李树刚王勇张伟辛渝但国平柴新娟龚会英于廷和

（1. 重庆科润生物医药研发有限公司，重庆 401121；2. 重庆医科大学附属第二医院，重庆 400010）

重组羧肽酶G2的原核表达、纯化及活性分析

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（1. 重庆科润生物医药研发有限公司，重庆 401121；2. 重庆医科大学附属第二医院，重庆 400010）

在原核表达系统中实现羧肽酶G2（Carboxypeptidase G2，CPG2）的表达，并对CPG2进行了纯化和活性测定。通过PCR扩增得到编码CPG2的基因片段，利用基因重组技术构建原核表达质粒pET-30a-CPG2，在Escherichia coli中进行诱导表达，菌体经超声破碎后利用金属螯合亲和柱和阴离子交换层析柱对目标蛋白进行纯化。目的蛋白能够以可溶形式表达，SDS-PAGE和Western blotting检测有特异的蛋白表达条带。纯化的CPG2有降解氨甲喋吟（MTX）活性，酶活力达到400 U/mg。

羧肽酶G2；原核表达；纯化；氨甲喋吟

羧肽酶G2（carboxypeptidase G2，CPG2）是羧肽酶G家族成员之一，最初是从假单胞菌属（Pseudomonas）菌株RS-16中分离获得［1］。羧肽酶G可水解叶酸及其衍生物的C端谷氨酸残基［2-4］。CPG2在物理特性与动力学特征上与羧肽酶Gl（CPGl）类似，但其对MTX的亲和力要高于CPGl。

CPG2全序列为415个氨基酸，其中包含一个25个氨基酸的信号肽序列和390个氨基酸的成熟蛋白序列。CPG2活性分子为同源二聚体，分子量83 kD-84 kD，催化活性需Zn2+。最初CPG2的制备是RS-16发酵而来，表达量仅为200-300 U/L，且CPG2表达量低于菌体总蛋白的0.1%，不能满足研发的需要［5，6］。因此，用基因工程的方法生产重组羧肽酶G2是另一选择。

CPG2分子无糖基化和二硫键，用原核系统表达是首选。近年CPG2基因已用基因工程的方法表达重组CPG2［7，8］。……