王瑞生，张振凌，王胜超，李柯柯，孙翼飞

(河南中医学院，河南 郑州 450008)

HPLC法同时测定五倍子发酵百药煎中没食子酸及鞣花酸含量△

王瑞生，张振凌*，王胜超，李柯柯，孙翼飞

(河南中医学院，河南 郑州450008)

目的：建立同时测定五倍子发酵百药煎中抗氧化活性成分没食子酸和鞣花酸含量的方法，并对不同批次五倍子发酵百药煎中的含量进行比较。方法：反相高效液相色谱法，WatersSymmmetryShieldTMRP18(4.6×250mm，5μm)C18色谱柱；流动相：乙腈-0.1%三氟乙酸水，梯度洗脱；流速1.0mL·min-1；检测波长254nm；柱温35℃。结果：五倍子没食子酸和鞣花酸含量分别为3.94%，0.25%；发酵成百药煎含量增加，分别为14.20%，0.26%。结论：所建方法操作简便、准确、重复性好，适用于同时测定五倍子发酵百药煎中没食子酸和鞣花酸的含量，含量测定结果为百药煎的药用研究和产品的开发提供了依据。

百药煎；没食子酸；鞣花酸；含量测定

百药煎始载于《丹溪心法》[1]，为五倍子同茶叶等经发酵制成的块状物。性味：酸甘，平。具有润肺化痰，生津止渴的功效。临床多用于治疗久咳痰多，咽痛，便血，久痢脱肛，口疮，牙疳，痈肿疮疡[2]。五倍子主要含没食子酸和鞣质类成分，发酵工艺对其有效成分的含量具有一定的差别[3]。目前关于百药煎的质量控制多数停留在性状和没食酸子酸含量测定[4]，对于鞣花酸含量测定文献报道不多。由于鞣花酸抗病毒、抗氧化、镇静等作用[5]与百药煎抗炎、抗菌、镇咳等药效作用一致[6]，将鞣花酸含量作为百药煎质量控制的指标，具有重要的参考价值。因此，本文建立同时测定百药煎药材中没食子酸和鞣花酸含量的HPLC方法，比较发酵对百药煎中没食子酸和鞣花酸的含量的影响，为百药煎的质量控制和开发应用提供更全面的科学依据。

1 仪器与材料

1.1仪器

高效液相色谱分析仪(Waters，Waters2489UV检测器)，breeze数据处理系统，KQ-500DV型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，BS210S万分之一电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)，BT25S十万分之一电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。

1.2试剂

没食子酸标准品(成都普斯生物科技有限公司，批号：P0380052，纯度>98.5%)，鞣花酸标准品(成都普斯生物科技有限公司，批号：P1440035，纯度>98%)，乙腈(迪马科技有限公司)，三氟乙酸(分析纯)，甲醇(天津四有精细化学品有限公司，批号：140325，一级色谱纯)，双蒸水(自制)，安琪酿酒曲(湖北宜昌安琪有限公司，批号：20150120)，绿茶(河南信阳茶叶专业市场)。

1.3药材

五倍子购于安徽亳州中药饮片厂，批号：20130812，经河南中医学院张振凌教授鉴定为漆树科植物盐肤木RhuschinensisMill.等树上寄生倍蚜科昆虫角倍蚜或倍蛋蚜后形成的虫瘿，符合《中国药典》2010年版：“五倍子”项下的各项规定。百药煎为本实验室炮制，批号为20141203-z，20141219-z，20150123-z，20150129-z，20150731-z，及杭州桐君堂生物科技有限公司提供，批号为20150301-q。

2 方法与结果

2.1样品的制备

2.1.1五倍子 将五倍子药材洗净，60℃干燥10h，粉碎，过80目筛。

2.1.2百药煎 置60℃烘箱中烘干，粉碎，过四号筛，备用。

2.2供试品溶液的制备

分别取各批次五倍子及百药煎粉末(过四号筛)约0.2g，精密称定，加入甲醇50mL，称定重量，放置2h，超声提取40min，放至室温，补足重量，过滤，取续滤液，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.3对照品溶液的制备

精密称取没食子酸标准品0.02009g，置于25mL容量瓶，甲醇溶解定容，得浓度为0.8036mg·mL-1没食子酸标准品溶液；精密称取鞣花酸标准品0.00339g，置于100mL容量瓶，甲醇溶解定容，移取1mL，置于2mL容量瓶，甲醇定容，得0.01695mg·mL-1鞣花酸标准品溶液。

2.4色谱条件考察

色谱柱：WatersSymmmetryShieldTMRP18(4.6×250mm，5μm)；其他条件进行研究如下。

2.4.1提取方法考察[7]考察了超声提取和回流提取2种提取方法，依次进行HPLC分析，结果显示超声提取效率更高，选择超声为提取方法。选取50%甲醇，95%乙醇和甲醇3个提取溶剂进行了考察，结果显示甲醇对百药煎中没食子酸及鞣花酸的提取率最高，因此选择甲醇为提取溶剂。比较了不同的超声时间(20，40，60min)，结果表明超声40min和60min提取率均较高，二者之间无显著性差异，因此选择超声时间为40min。

2.4.2洗脱程序考察

2.4.2.1方法一[8]：流动相为乙腈和1%冰乙酸，梯度洗脱，流速1mL·min-1，柱温35℃，检测波长为248nm，进样量10uL。梯度洗脱程序为0～10min，18%乙腈；10～15min，18%～20%乙腈。

2.4.2.2方法二[9]：流动相为乙腈(A)-0.25%甲酸溶液(B)，梯度洗脱，流速0.85mL·min-1，柱温25℃，检测波长260nm，进样量10uL。梯度洗脱程序为0～6min，3%～5%B；6～15min，5%～8%B；15～17min，8%～15%B；17～25min，15～18%B；25～33min，18%～22%B；33～35min，22%～25%B；35～40min，25%～50%B；40～45min，50%～100%B。

2.4.2.3方法三[10]：流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱，流速1.0mL·min-1，柱温为30℃，检测波长280nm，进样量10uL。梯度洗脱程序为0～15min，10%甲醇；15～20min，10%～50%甲醇；20～40min，50%甲醇。

2.4.2.4方法四：流动相为乙腈-1%三氟乙酸，梯度洗脱，流速1mL·min-1，柱温35℃，检测波长为254nm[11]，进样量10uL。梯度洗脱程序为0～10min，18%乙腈；10～15min：18%～20%乙腈。

对比以上四种方法得到的色谱图，根据没食子酸及鞣花酸色谱峰的峰型，峰面积，分离度及峰高，选择方法四检测百药煎中没食子酸及鞣花酸含量测定的色谱条件。

2.4.3流动相考察 对比乙腈-0.1%甲酸，乙腈-0.1磷酸，乙腈-0.1%冰醋酸，乙腈-0.1%三氟乙酸，根据色谱图峰面积、分离度及峰型，选择乙腈-0.1%三氟乙酸为流动相，结果见图1。

A：乙腈-0.1%甲酸，B：乙腈-0.1%磷酸，C：乙腈-0.1%冰醋酸，D：乙腈-0.1%三氟乙酸图1 百药煎不同流动相色谱图

2.4.4检测波长考察 将没食子酸标品，鞣花酸标品及百药煎样品进行全波长扫描，扫描范围：190nm-600nm，扫描间距：1nm，结果见图2。没食子酸在246nm，254nm，286nm，293nm处有最大吸收；鞣花酸在254nm，365nm处有最大吸收；百药煎样品在238nm，250nm，262nm，286nm，305nm处有最大吸收。综合实验数据及参考文献选择对比248nm，254nm，260nm，280nm四个波长下色谱图，最终选择254nm为检测波长，结果见图3。

A：没食子酸标品图，B：鞣花酸标品图，C：百药煎样品图图2 百药煎标准品及样品全波长扫描图

2.4.5柱温考察 对比30℃，35℃，40℃三个检测温度下的色谱图，30℃色谱图峰高和分离度均较低，35℃与40℃色谱图差别较小，考虑到40℃，温度较高对仪器及色谱柱有影响，选择35℃为检测柱温，结果见图4。

经以上比较，确定流动相：乙腈-0.1%三氟乙酸水，按表1梯度洗脱；流速1mL·min-1；检测波长254nm；柱温35℃；进样量10μL。

表1 百药煎没食子酸及鞣花酸含量测定梯度洗脱程序

A：248 nm，B：254 nm，C：260 nm，D：280 nm图3 百药煎不同检测波长色谱图

A：30 ℃，B：35 ℃，C：40 ℃图4 百药煎不同检测柱温色谱图

2.5方法学考察

图5 没食子酸标准曲线

图6 鞣花酸标准曲线

2.5.1线性关系考察 取对照品溶液，分别进样2、4、6、8、10uL，以峰面积为纵坐标，进样量(ug)为横坐标，绘制标准曲线，Y没食子酸=1337951.72X+613105(R2=0.9997)，Y鞣花酸=5240147.49X-1416(0.9994)。结果表明没食子酸和鞣花酸分别在1.6072～8.0360ug，0.0339～0.1695ug呈良好线性，见图5，图6。2.5.2精密度实验 取20150129百药煎粉末(过四号筛)约0.2g，精密称定，按2.3.项下供试品溶液的制备方法操作，进样量10μL，连续进样5次，记录没食子酸、鞣花酸峰面积，以没食子酸、鞣花酸峰面积计算，测定值的RSD分别为3.41%，1.11%，表明系统的精密度较好。

2.5.3 稳定性试验 取20150129百药煎粉末(过四号筛)约0.2g，精密称定，按2.3.项下供试品溶液的制备方法操作，分别在0h、2h、4h、8h、12h检测，记录没食子酸、鞣花酸峰面积，以没食子酸、鞣花酸峰面积计算，测定值的RSD分别为 0.28%，0.33%，表明样品在12h内稳定性良好。

2.5.4 重复性试验 取20150129百药煎粉末(过四号筛)5份，每份约0.2g，精密称定，按2.3.项下供试品溶液的制备方法操作，分别进样10μL，记录没食子酸、鞣花酸峰面积，以没食子酸、鞣花酸峰面积计算，测定值的RSD分别为 1.09%，2.02%，表明方法重复性良好。

2.5.5 加样回收率试验 取已知含量的百药煎样品(20150129)粉末5份，加入一定量的没食子酸和鞣花酸对照品，测定并计算回收率，结果见表2，表3。

表2 没食子酸加样回收率(n=6)

表3 鞣花酸加样回收率(n=6)

2.6 含量测定 称取3份五倍子样品和6批次百药煎样品，按2.3项下制备下列批次的待测样品溶液，进样量为10 μL，分别注入高效液相色谱仪，测定色谱峰峰面积，对照品溶液和百药煎供试品的HPLC色谱图，见图7。结果见表4。

1：没食子酸 2：鞣花酸；图A：没食子酸标品图，B：鞣花酸标品图，C：百药煎样品图图7 百药煎标准品及样品HPLC

样品批号没食子酸/%平均值/%鞣花酸/%平均值/%五倍子20130812-13.884.023.950.250.240.2520130812-23.673.923.800.230.240.2420130812-34.114.054.080.250.260.26百药煎20141203-z13.7813.8213.800.250.250.2520141219-z14.0814.1214.100.260.260.2620150129-z14.0714.0314.050.260.260.2620150324-z14.5514.6014.580.260.260.2620150731-z14.1614.2214.190.260.260.2620150301-q31.3731.9831.680.180.190.19

3 讨论

3.1

本文建立同时测定百药煎中没食子酸及鞣花酸含量的方法，比较了不同提取方法工艺条件以及不同检测波长、不同检测柱温、不同梯度洗脱比例对没食子酸及鞣花酸含量的影响。与文献报道[8]的同时测定五倍子中没食子酸及鞣花酸含量的方法对比，本文所建立方法同时测定五倍子发酵前后没食子酸及鞣花酸含量，比较发酵前后成分含量变化，对于五倍子发酵过程的控制具有一定指导意义。五倍子中鞣质含量高达60%～80%[12]，发酵后鞣质的水解产物包括没食子酸和鞣花酸。本次测定结果证明五倍子没食子酸含量为3.94%，实验室发酵炮制百药煎含量为14.20%，增加3.6倍；五倍子鞣花酸含量为0.25%，发酵制成百药煎后含量为0.26%，含量稍有增加。考虑五倍子发酵炮制百药煎的过程中加入了茶叶、茶汁及酿酒曲，质量增加40%，因此，计算得没食子酸含量实际增加5.04倍，鞣花酸含量实际增加量为0.11%。说明发酵过程中五倍子鞣质水解，部分生成没食子酸及鞣花酸。

3.2

有文献报道，鞣花酸具有抗癌、抗突变性能，对人体免疫缺陷病毒的抑制作用抗氧化作用，具有凝血功能[5]，对多种细菌、病毒都有很好的抑制作用[13]，有降压、镇静作用[14]。本研究对生产企业提供的百药煎进行研究，发现与本实验室制备的百药煎不同，没食子酸含量增加8倍，鞣花酸含量降低0.07%，说明发酵时间、菌种、发酵程度的控制等工艺条件对五倍子发酵炮制的百药煎成分的种类与含量均有显著影响。因此，五倍子发酵炮制百药煎的转化是将鞣质全部或者尽可能多地转化成为没食子酸，还是保留一部分中间成分，尚需要进一步通过药理功效甚至是中药临床功效的进一步验证研究。其处方、工艺条件尤其是发酵程度的控制也需要进一步研究。

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DeterminationofGallicAcidandEllagicAcidinGallnutFermentedChineseGallLeavenbyHPLC

WANGRuisheng，ZHANGZhenling*，WANGShengchao，LIKeke，SUNYifei

(HenanUniversityofChineseMedicine，Zhengzhou450008，China)

Objective：To determine the gallic acid and ellagic acid in the gallnut fermented Chinese gall leaven by HPLC and compare the content of different batches.Methods：The separation was performed on the Waters Symmmetry ShieldTMRP18(4.6×250mm，5μm) C18column，and acetonitrile-0.1% trifluoroacetic acid aqueous in gradient as mobile phase，the flow rate was1.0mL·min-1，and the detecting wavelength was set at254nm，the column temperature was kept at35℃.Results：The average content of gallic acid and ellagic acid in Chinese gall were3.94% and0.25%，respectively，and in Chinese gall leaven were14.20%，0.26%，respectively.Conclusion：The established method is suitable for the determination of gallic acid and ellagicacid in the gallnut fermented Chinese gall leaven.The results provide a basis for medicinal value research and product development of gallnut fermented Chinese gall leaven.

Chinese gall leaven；gallic acid；ellagic acid；determination

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.007

2016-01-30)

六神曲等7种中药发酵技术及规范化应用研究--百药煎(201507004-03)；呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心-研究生科研创新基金项目(20140013)

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张振凌，博士生导师;研究反向：中药饮片及新药研究；Tel：(0371)65680970，E-mail：zhangzl6758@163.com