陈江宁，单国顺，刘晓瑜，高慧*

(1.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600；2.辽宁省中药炮制工程技术研究中心，辽宁 大连 116600)

胆南星辅料成分分析及其清热作用△

陈江宁1，2，单国顺1，2，刘晓瑜1，2，高慧1，2*

(1.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连116600；2.辽宁省中药炮制工程技术研究中心，辽宁 大连116600)

目的：通过比较猪、牛、羊胆汁中胆酸类成分和对发热小鼠清热作用的差异，为胆南星炮制辅料的筛选提供参考依据。方法：采用HPLC-CAD法检测三种胆汁中胆酸类成分(胆酸、去氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺胆酸钠)。色谱条件为WatersC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为0.5%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，体积流量：1mL·min-1；进样量：20μL，Corona参数：氮气压力为35psi(241.3Kpa)，Filter：high，Range200pA。以干酵母制备小鼠发热模型，观察猪、牛、羊胆汁对发热小鼠体温的影响。结果：猪、牛、羊胆汁中胆酸类成分存在明显差异，五种胆酸总量分别为1.4950%、0.3540%、0.5976%，猪胆汁中猪去氧胆酸含量最多，为1.1287%。猪、牛、羊胆汁对发热小鼠均有一定的清热作用，猪胆汁在6h时表现出清热作用但不持久。牛胆汁在8h时表现出较明显的清热作用。羊胆汁清热作用最明显且持久。结论：猪、牛、羊胆汁无论胆酸类成分含量还是清热作用均存在明显差异，提示我们应对药典规定的胆南星的三种胆汁进行区分，将其分别发酵制成胆南星后并结合药效评价再进行筛选。

胆南星胆汁；高效液相色谱；胆酸；解热

胆汁为来源于猪科动物猪SusscrofadomesticaBrisso，牛科动物黄牛BosTaurusdomesticusGmelin或水牛BubalusL，牛科动物山羊CaprahircusL及绵羊OvisariesL的胆汁[1]。胆汁性苦寒，具有清热解毒、利湿、止咳、通便等功效[2]。胆南星是由天南星与猪、牛、羊胆汁混合，经发酵制成，药性由温转凉，功效由温化寒痰转变为清化热痰。目前胆南星的炮制辅料和炮制工艺尚无统一标准。由于胆汁中的胆汁酸类成分具有一定的药效活性，故本文通过比较研究三种胆汁中胆酸类成分和对发热小鼠清热作用的差异，为筛选发酵胆南星所需的辅料和统一胆南星的炮制工艺提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1仪器

LC-20AB高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Corona电雾式检测器(美国ESA公司)；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；MettlerAE240型十万分之一分析天平(瑞士Mettler公司)；FA1004B型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；HWS-080恒温恒湿箱(上海精宏实验设备有限公司)；电子体温计(欧姆龙(大连)有限公司)；干酵母(安琪酵母股份有限公司)。

1.2试药

胆酸、去氧胆酸、猪去氧胆酸对照品均购自中国食品药品检定研究院，批号分别为100078-201415、110724-200207、100087-201411，质量分数均≥98%；鹅去氧胆酸、牛磺胆酸钠对照品均购自上海源叶生物科技有限公司，批号分别为ZO1011LA14、Z25M3L1，质量分数均≥98%；乙腈、甲醇为色谱纯；水为纯水。猪、牛、羊胆汁购于大连开发区湾里商场。

2 方法与结果

2.1胆酸类成分含量测定[3]

2.1.1胆酸类成分对照品溶液的制备 精密称取胆酸、去氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺胆酸钠适量，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成质量浓度分别为0.0426、0.0453、0.051、0.026、0.024mg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2胆酸类成分供试品溶液的制备 猪、牛、羊胆汁为趁鲜破胆取得，置棕色瓶，于-20℃保存，备用。

精密称取猪、牛、羊胆汁各2g，置50mL量瓶中，加入适量甲醇并超声提取1h，放冷至室温，补足甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.1.3胆酸类成分含量测定色谱条件WatersC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)流动相为0.5%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱条件：0～5min，40%A～50%A；5～25min，50%A～57%A；体积流量：1mL·min-1；进样量：20μL，Corona参数：氮气压力为35psi(241.3Kpa)，Filter：high，Range200pA[2]。

1.胆酸；2.猪去氧胆酸；3.牛磺胆酸钠；4.鹅去氧胆酸；5.去氧胆酸图 1胆酸、去氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺胆酸钠对照品色谱图

1.胆酸；2.猪去氧胆酸；3.牛磺胆酸钠；4.鹅去氧胆酸；5.去氧胆酸图2 羊胆汁中胆酸类成分色图谱

2.1.4方法学考察

2.1.4.1线性关系考察 精密吸取各胆酸类对照品溶液适量，注入液相色谱仪，测定，并记录峰面积。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程，胆酸：Y=3149097.5910x+49800.5902(r=0.9992)，去氧胆酸：Y=1319880.8592x+2677.1690(r=0.9997)，猪去氧胆酸：Y=1022475x-26477.3854(r=0.9997)，鹅去氧胆酸：Y=275884.1685x+341.3370(r=0.9999)，牛磺胆酸钠：Y=1834609.8531x-15358.4262(r=0.9997)，结果表明五种胆酸类成分的进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.4.2精密度试验 精密吸取各对照品溶液20μL，重复进样6次，计算得胆酸、去氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺胆酸钠峰面积的RSD值分别为1.5%、1.8%、2.1%、1.1%、1.3%，结果表明仪器精密度良好，色谱图见图1。

2.1.4.3稳定性试验 取猪胆汁供试品溶液，分别在0、2、4、6、10、24h进样，计算得胆酸、去氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺胆酸钠峰面积的RSD值分别为1.9%、2.0%、1.2%、1.6%、1.5%，结果表明供试品溶液在24h内稳定。

2.1.4.4重复性试验 精密称取同一批猪胆汁6份，制备供试品溶液，进样测定，计算得胆酸、去氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺胆酸钠质量分数的RSD值分别为0.7%、1.2%、2.4%、1.4%、2.1%，结果表明本方法重复性良好。

2.1.4.5加样回收率试验 取已知含量的猪胆汁样品1g，平行6份，精密称定，分别精密加入0.0426mg·mL-1胆酸、0.051mg·mL-1猪去氧胆酸、0.024mg·mL-1牛磺胆酸钠、0.026mg·mL-1鹅去氧胆酸、0.0453mg·mL-1去氧胆酸对照品溶液适量，制备供试品溶液，进样测定，计算回收率，结果见表1。

2.1.5含量测定 分别精密吸取牛、羊、猪胆汁供试品溶液20、10、10μL，按照“2.1.3”项下色谱条件进行含量测定，外标法计算各胆汁中五种胆酸类成分的质量分数，结果见表2。

2.1.6结果 猪、牛、羊三种胆汁中所含的成分有一定的差异。羊胆汁中检测出上述五种胆酸类成分，但在牛胆汁和猪胆汁中分别未检测出鹅去氧胆酸和去氧胆酸。同时，胆酸类成分的含量差异亦较大，猪、牛、羊胆汁中五种胆汁酸类成分总量分别为1.4950%、0.3540%、0.5976%，猪胆汁含有猪去氧胆酸的量最多，为1.1287%。三种胆汁中牛磺胆酸钠含量均达到0.2%以上。

2.2小鼠清热实验

2.2.1干酵母混悬溶液的制备[4-6]称取干酵母2g于乳钵中，逐渐加入蒸馏水研磨为均匀的悬浆，并定容于10mL量瓶中，即得20%酵母混悬液(现用现配)。

2.2.2动物及造模给药[7]SPF级KM小鼠40只，体重18～22g(购于辽宁长生生物技术有限公司，许可证号：SCXK(辽)2015-00011)。小鼠适应性喂养一周，自由饮食饮水，室温(22±2)℃。

表1 猪胆汁中五种胆酸成分加样回收率试验(n=6)

表2 不同胆汁中胆酸类成分含量(%)

注：—表示未检测出该成分

造模前，小鼠分别于每日上午8：00和下午3：00测量肛温，连续测定3天。(将体温计于探头后3 cm处进行标记，确保体温计每次伸入动物体内的长度一致)选取体温在36.6～38.0 ℃且连续体温变化小于0.3 ℃的小鼠，取其平均值作为正常基础体温。按照体温基础值和体重均衡随机分成5组，每组8只，分别为空白组、模型组、猪胆汁组、羊胆汁组、牛胆汁组。称重后各组小鼠以10 mL/kg剂量皮下注射20%干酵母混悬液进行造模，同时灌胃胆汁(10 mL/kg)，空白对照组注射和给予同体积生理盐水。于给药后2.0、3.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、12.0 h 测定肛温，与基础体温比较，计算温差。

2.2.4 结果 观察小鼠体温12 h内的变化情况，由表3可以看出，各组和模型组相比，猪、牛、羊胆汁对发热小鼠均有一定的清热作用。其中，猪胆汁在6 h时表现出清热作用但不持久。牛胆汁在8 h时表现出较明显的清热作用。羊胆汁清热作用最明显且持久。

表3 三种胆汁对发热小鼠体温变化的影响

注：与模型组比较*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

由于胆汁中的胆酸类成分没有紫外吸收，王一博[3]等对HPLC-CAD法和HPLC-ELSD法测定胆汁中胆酸类成分进行了分析比较，结果表明HPLC-CAD法更适合胆酸类成分的测定，因此本实验采用HPLC-CAD法检测猪、牛、羊胆汁中五种胆酸类成分的含量，本方法简便、准确，重复性较好。实验数据表明，猪、牛、羊胆汁中胆酸类成分存在明显差异，五种胆酸总量分别为1.495 0%、0.354 0%、0.597 6%，其中猪胆汁中5种胆酸总量最高，主要是猪去氧胆酸含量高，为1.128 7%，但去氧胆酸未检出。牛胆汁中5种胆酸总量最低，其中鹅去氧胆酸未检出，胆酸含量明显偏低。三种胆汁中牛磺胆酸钠含量相对比较接近，在0.2%-0.5%之间。

猪、牛、羊胆汁对发热小鼠均有一定的清热作用，其中，猪胆汁在6 h时表现出清热作用但不持久。牛胆汁在8 h时表现出较明显的清热作用。羊胆汁清热作用最明显且持久。

胆南星是一味药用历史悠久的曲剂，清朝的《幼幼集成》记载“能装过九胆诚为至宝，任彼真正牛黄莫能及此”[8]。虽然胆南星有着较好的临床疗效，但是现行的药典和各省炮制规范对胆南星的炮制工艺并没有一个统一的标准，市场加工及应用情况较为混乱，没有最大的发挥出胆南星的药用价值。本实验对不同胆汁中的胆酸成分和解热作用进行了比较研究，发现猪、牛、羊胆汁无论胆酸类成分含量还是清热作用均存在明显差异，我们应对药典规定的胆南星的三种胆汁进行区分，将其分别发酵制成胆南星并结合药效评价再进行筛选。包括制成胆南星后的成分及作用比较，筛选出胆南星的适宜辅料、统一胆南星的炮制工艺。

[1] 蒋蕾.羊胆汁与其主要成分抗炎作用及作用机制的比较研究[D].黑龙江中医药大学，2007.

[2] 中国药典[S].一部.2015：319.

[3] 王一博，王春雨，曲范娜，等 高效液相色谱-电雾式检测器同时测定猪、牛、羊、熊胆粉中5种胆汁酸的含量[J].分析化学，2014，42(1)：109-112.

[4] 冯淑怡，李先荣，孙建宁.连翘酯苷抗感染、解热作用研究[J].现代生物学进展，2006，6(10)：73-75.

[5] 段红妍，赵 琴，马 成.银花连翘配伍对发热大鼠体温和血清NO含量的影响[J].新疆中医药，2009，27(2)：11-13.

[6] 段红妍，马 成.金银花与连翘配伍退热机制的实验研究[J].现代中西医结合杂志，2009，18(11)：1214.

[7] 陈慧慧，张 敏，虞慧娟.等柴胡和黄芩配伍解热抗炎作用研究[J].中成药，2011，33(9)：1596-1598.

[8] 陈复正.幼幼集成(清刊本，卷二)[M].38.

CompositionAnalysisandCompareofClearingHeatEffectsamongArisaemacumBileProcessing

CHENJiangning1，2，SHANGuoshun1，2，LIUXiaoyu1，2，GAOHui1，2*

(1.LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China；2.ChineseMateriaMedicaProcessingEngineeringCenterofLiaoningProvince，Dalian116600，China)

Objective：To compare bile acids composition in pig’s bile，bilis bovina，shee Pbile and differences of clearing heat effect in mice，and provide a reference basis for screening out the arisaema cum bile processing adjuvants.Methods：HPLC-CAD method was used to detect the bile acid composition (cholic acid，deoxidationcholic acid，hyodeoxycholic acid，chenodeoxycholic acid，sodium taurocholic acid) in three kinds of bile.The chromatographic condition was following：Waters C18column (250mm×4.6mm，5μm)，0.5% Formic acid water (A)-Acetonitrile (B)，gradient elution，Volume flow：1mL·min-1，Corona parameters：the nitrogen pressure was35psi (241.3Kpa)，the Filter：high，Range200pA.The fever model of mice was induce with dry yeast，the effects of clearing the heat on the model among pig’s bile，bilis bovina and shee Pbile were observed and compared.Results：The total amount of the five kinds of bile acids in pig’s bile，bilis bovina，shee Pbile were1.4954%，0.3540% and1.4954%.pig’s bile contains the most amount of hyodeoxycholic acid，was1.1287%.The3kinds of biles all showed clearing heat function.The pig’s bile showed clearing heat effect at6h but not persistent.Bilis bovina showed a significant effect of clearing heat at8h.Shee Pbile could clear heat significant and persistent.Conclusion：Both the contents of five kinds of bile acids and the effects of clearing heat are different among the pig’s bile，bilis bovina，shee Pbile,In pharmacopoeia we distinguish the Pinellia Cum Bile with three kinds of bile,then we use pharmacodynamic evaluation to filt the which bile fermente Arisaema Cum Bile is best.

Arisaema cum Bile；HPLC-CAD；cholic acid；clearing heat

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.008

2016-02-01)

公益性行业科研专项(No.201507004-03)

*

高慧，教授，博士;研究方向：中药炮制原理；电话：0411-85890146，E-mail：gaohuitcm@163.com