付铨盛，卫滢，席秀丽，黄海波

(广州中医药大学 中药学院，广东 广州 510006)

·基础研究·

毛冬青基因组DNA提取方法及ISSR-PCR反应体系的优化△

付铨盛，卫滢，席秀丽，黄海波*

(广州中医药大学 中药学院，广东 广州 510006)

目的：优化毛冬青基因组DNA提取方法，建立稳定性高、重现性好、适合其遗传差异分析的ISSR-PCR反应体系。方法：对比CTAB法、mCTAB法、SDS法、蛋白酶K法及植物基因组提取试剂盒的提取效果后，选择mCTAB法结合蛋白酶K法提取毛冬青基因组DNA，并优化了蛋白酶K用量。利用正交试验设计，对毛冬青ISSR-PCR反应的5个因素(Mg2+、dNTPs、Primer、DNA、Taq酶)进行优化，PCR结果使用SPSS16.0软件进行分析，基于优化后体系对哥伦比亚大学公布的100条ISSR引物进行筛选，确定退火温度。结果：采用蛋白酶K-mCTAB法实现了4 h内提取高纯度毛冬青基因组DNA，蛋白酶K用量为20 ng·mL-1时DNA平均提取量较传统CTAB法提升9.5倍；毛冬青ISSR-PCR最终反应体系为Mg2+2.5 mmol·L-1，dNTPs 0.15 mmol·L-1，Primer 0.4 μmol·L-1，DNA 70 ng，Taq酶0.5 U。实验从100条引物中筛选出16条引物并确定退火温度，绘制出毛冬青ISSR指纹图谱。结论：蛋白酶K-mCTAB法适合毛冬青基因组DNA的提取，筛选出的反应体系、引物及退火温度能够满足毛冬青ISSR-PCR实验的要求。

毛冬青；DNA提取；反应体系优化；引物筛选

中药毛冬青是冬青科(Aquifoliaceae)冬青属植物毛冬青IlexpubescensHook.et Arn.的干燥根。药理研究显示，其具有抗菌[1]、舒缓气管平滑肌[2]、抑制血小板聚集[3]、扩张冠脉等作用，主要用于治疗冠心病、心绞痛及脉管炎等疾病，疗效确切，已有多种以毛冬青为主药的方剂收载于卫生部部颁标准中。

近年来毛冬青的研究主要集中于植物化学[4]和药理学方面[5]；分子生物学方面研究较少，主要集中在基于ITS序列的分子鉴别方向[6]。为加深对毛冬青种质资源多样性、系统发育研究，本研究将优化其DNA提取方法及ISSR-PCR反应体系，并尝试构建毛冬青的ISSR指纹图谱。

1 材料

1.1 材料及处理

实验材料采自广东省梅州市平远县，经广州中医药大学中药鉴定教研室黄海波副教授鉴定为冬青科(Aquifoliaceae)冬青属植物毛冬青IlexpubescensHook.et Arn.。材料选取新鲜幼嫩毛冬青叶片，用70%乙醇水溶液清洁表面后迅速置于放有变色硅胶的塑封袋中快速干燥备用。

1.2 仪器和试剂

OSE-Y20电动研磨杵(天根生化科技有限公司)、T100 PCR仪(Bio-Rad)、Powerpac Basic电泳仪(Bio-Rad )、OSE-260核酸蛋白分析仪(天根生化科技有限公司)、Tanon-2500凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)。

dNTPs、Ex TaqDNA聚合酶、Mg2+、10x Ex Taq Buffer、Marker、蛋白酶K、RNase(Takara公司)，聚乙烯比咯烷酮(PVP)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、β-巯基乙醇(Sigma公司)，植物基因组提取试剂盒(天根生化科技)，其余为国产分析纯试剂；引物根据哥伦比亚大学提供的ISSR引物序列由北京六合华大基因科技有限公司合成。

2 方法

2.1 DNA提取及纯化

实验对比CTAB法[7]、mCTAB法[8]、SDS法[9]、蛋白酶K法[10]、植物基因组提取试剂盒5种提取方法后，选择mCTAB法结合蛋白酶K法作为最终方法进行提取。

2.1.1 缓冲液配制 缓冲液A由100 mmol·L-1Tris-HCl (pH 8.0)、5 mmol·L-1EDTA-Na2、0.25 mmol·L-1NaCl组成，使用前加入20 mg·mL-1PVP-40T。缓冲液B由100 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)、25 mmol·L-1EDTA-Na2、1.4 mmol·L-1NaCl、40 mg·mL-1CTAB、10 mg·mL-1抗环血酸组成，使用前加入20 mg·mL-1PVP-40T、10 mg·mL-1Na2B4O7·10H2O 、0.4%β-巯基乙醇。

2.1.2 提取方法 取40 mg去主脉干燥叶片，用电动研磨杵加适量液氮研磨15 s；加入1 mL的缓冲液A冰浴10 min，期间颠倒混匀数次；12 000 r·min-1(13 400×g)离心5 min弃上清液；重复加入缓冲液A至上清液黏稠度下降；加入1 mL 缓冲液B、20 μL(20 mg·mL-1)蛋白酶 K，65 ℃水浴30 min，每10 min颠倒混匀1次；待样品冷却至室温，12 000 r·min-1(13 400×g)离心5 min；取上清液，加入等体积苯酚-三氯甲烷-异戊醇(25∶24∶1)，缓慢颠倒混匀10 min使两者充分混合均匀，12 000 r·min-1(13 400×g)离心5 min，取上清液；重复加入苯酚-三氯甲烷-异戊醇(25∶24∶1)至上层液体澄清；取上清液加入等体积三氯甲烷-异戊醇(24∶1)，缓慢颠倒混匀10 min，12 000 r·min-1(13 400×g)离心5 min；取上清液加入100 μL 3 mol·L-1NaAc及等体积预冷异丙醇，轻轻混匀，-20 ℃保存30 min；12 000 r·min-1(13 400×g)离心5 min，弃上清液；加入0.1 mL 100 mg·L-1RNase，37 ℃消化30 min；加入0.1 mL去离子水、0.1 mL 5 mol·L-1NaCl，0.8 mL预冷95%乙醇，轻轻混匀，12 000 r·min-1(13 400×g)离心5 min，弃上清液；加入0.5 mL 90%乙醇，轻轻弹起沉淀，12 000 r·min-1(13 400×g)离心2 min，弃上清液，重复本步骤1次；无菌环境敞开EP管口挥干乙醇，加入0.1 mL TE溶解DNA过夜。样品经1%琼脂糖凝胶电泳，选择无拖尾、带形清晰的样品用核酸蛋白仪检测浓度，统一稀释至50 ng·μL-1，供后续实验用。

2.2 单因素考察蛋白酶K用量

实验采用单因素考察的方式对蛋白酶K使用量进行考察，设置5、10、15、20 μL·mL-14个水平，每个水平设置2个重复。

2.3 正交设计优化PCR反应体系

针对影响PCR反应的Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物和模板等的浓度5个因素，以预试验优化过的UBC807为实验引物，选用L16(45)正交表，在4个浓度水平上进行试验，正交设计见表3。

表3 毛冬青PCR反应体系优化正交设计表

正交试验共16组，每组设2个重复，合计32个反应。PCR反应体系为20 μL，扩增程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35次循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，电泳条件为80 V 15 min，100 V 30 min，结果经凝胶成像系统拍照分析。

2.4 引物筛选及退火温度优化

采用优化后反应体系对哥伦比亚大学公布的100条ISSR引物在其TM值上2 ℃进行筛选，选择条带数量多、间距合适、基本清晰的引物进行退火温度优化。使用T100 PCR仪在50～56 ℃自动生成8个温度梯度，选择50.0、51.1、52.3、53.7、54.8、56.0 ℃进行退火温度筛选。

3 结果与分析

3.1 不同提取方法DNA提取结果

5种方法提取的DNA在TGem 超微量分光光度计上检测结果如表4所示，高纯度DNA的A260/A280的值为1.7～1.9，若吸光度小于1.7则可能存在蛋白污染，大于2.0则DNA已降解或存在RNA残留。实验结果显示：采用CTAB法、mCTAB法、SDS法提取的组DNA的A260/A280均小于1.7，可能存在蛋白污染；mCTAB法平均提取量较CTAB法提升79%；蛋白酶K法处理的样品在质量和提取量上均有提升；植物基因组提取试剂盒采用硅基质膜吸附柱法对样品进行提取，特异性吸附DNA，故提取物纯度较高，但由于其成本高、柱容量有限，难以满足后续实验的要求，故选择mCTAB法结合蛋白酶K法进行提取。

3.2 不同剂量蛋白酶K对提取效果的影响

经蛋白酶K处理后，获得的毛冬青组DNA纯度高、完整型好，提取量随蛋白酶K使用量的增加而增加。在20 μL·mL-1水平下能够获得较高的提取量，综合考虑实验成本及实际需求，不建议继续增加蛋白酶K使用量。见表5、图1。

表4 不同方法提取毛冬青组cDNA结果(n=3)

注：*表示蛋白酶K使用量为10 μL·mL-1。

表5 蛋白酶K用量对毛冬青组DNA提取效果的影响(n=2)

图1 蛋白酶K-mCTAB法提取毛冬青组DNA电泳结果

3.3 ISSR-PCR反应体系的正交设计结果分析

使用引物UBC807进行反应体系优化的PCR产物电泳结果见图2，参考何正文等[11]的方法对扩增结果多态性进行评分：条带数量丰富、稳定、清晰的计15分，涂布带或无条带计1分，得分越高的反应体系扩增效果越好，反应1～16的平均计分依次为：3、11、15、13、4、7、12、14、4、8、9、12、4、1、3、10。依照参考文献计算，最终反应体系为Mg2+：2.5 mmol·L-1，dNTPs：0.15 mmol·L-1，Primer：0.4 μmol·L-1，DNA：70 ng，Taq酶：0.5 U。

注：A胶、B胶分别为反应体系正交试验两组重复。图2 反应体系正交试验电泳结果

3.4 引物、退火温度筛选

退火温度与引物、反应体系、模板种类等因素存在较大关系，温度过低会引发引物与模板错配，产生非特异性扩增，使条带模糊甚至拖带，退火温度过高则会抑制引物与模板的结合，导致扩增条带减少。本实验从初筛后有清晰条带的32条引物中优选出16条引物，对其退火温度进行进一步筛选，部分筛选结果见图3，最终引物及退火温度见表6。

图3 UBC813、814退火温度筛选结果

表6 毛冬青ISSR最终引物及退火温度

3.5 毛冬青ISSR指纹图谱的建立

最终引物的电泳结果使用Quantity One(Bio-red co.)软件进行处理，对带型好、辨析度高的序列排队及编号后，将电泳结果图转换为1/0原始矩阵，有条带记为“1”，无条带记为“0”，并根据该矩阵绘制毛冬青ISSR指纹图谱，见图4。

图4 毛冬青ISSR指纹图谱

4 讨论

完整度高、纯度高的DNA是ISSR-PCR准确可靠、重现性好的基本保障。毛冬青叶片内含有多糖、蛋白质、酸性及酚性皂苷类成分[12]，蛋白质及多糖容易与DNA形成复合物，使DNA溶解度降低，同时抑制Taq酶活性影响PCR扩增[13]；酚类与多酚氧化酶结合后极易氧化，在完整的细胞结构中二者被细胞膜分隔，因此较为稳定，当细胞破壁后，两者结合发生氧化反应影响DNA的质量[14]。

本实验结合mCTAB和蛋白酶K法对毛冬青基因组DNA进行提取，CTAB free的缓冲液A可去除大部分次生代谢产物，降低提取液黏稠程度，缓冲液B中的抗坏血酸、PVP、β-巯基乙醇和硼砂4种抑制因子共同作用，有效防止DNA的褐变；蛋白酶K的加入在减少DNase和RNase的同时有效地消化植物组织中与DNA结合的以及提取过程中与DNA形成共沉淀的蛋白质，使DNA游离于上清液中；结合苯酚-三氯甲烷-异戊醇(25∶24∶1)两次抽提，进一步减少了蛋白质和多糖的污染。本方法实现了4 h内获得高纯度、高浓度的毛冬青基因组DNA，为后续实验提供了保障。

近年来，利用分子标记技术对物种进行快速鉴定的技术发展迅速，其高分辨率能够提高检测效率、并降低成本，是未来鉴定的发展趋势。ISSR引物开发费用降低，与RAPD和RFLP相比，ISSR在获得数倍于RAPD信息量的同时其精确度几乎可以与RFLP相媲美。本研究采用正交设计法优化了毛冬青ISSR-PCR反应体系，从100条引物中筛选出16条背景清晰、带强高、重叠少的引物，其中，最多可扩增出15个条带，最少6个条带，16条引物合计扩增条带163条，平均每个引物扩增出10.2条。尝试建立了毛冬青的ISSR指纹图谱，为后期种质资源的遗传多样性、系统发育研究、基因标记、基因组作图和物种进化等方面的研究奠定基础，从分子角度规范毛冬青植物基原，并为冬青科其他物种的研究提供参考。

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OptimizationofGenomicDNAExtractMethodandISSR-PCRReactionSystemforIlexpubescens

FUQuansheng，WEIYing，XIXiuli，HuangHaibo*

(GuangzhouUniversityofChineseMedicine，Guangzhou510006，China)

Objective：To optimize genomic DNA extract method forIlexpubescens，and establish a stable，reproducible and suitable reaction system for its ISSR analysis of genetic differences.Methods：In this study，five frequently-used methods for plant genomic DNA extraction include CTAB，mCTAB，SDS，protein K and genomic DNA kit were compared for acquiring better DNA product quality and quantity.The optimized method combined mCTAB with Protein K，and the dosage of protein K was also optimized.The ISSR-PCR amplification system of five factors(Mg2+，dNTPs，primers，Taq DNA polymerase，and DNA template)forI.pubescenswas optimized by orthogonal design，the PCR result was analyzed by SPSS 16.0.Then based on the optimal ISSR-PCR amplification system，100 primers were selected and the annealing temperature was proposed by gradient determination.Results：With protein K-mCTAB，the genomic DNA extraction fromI.pubescenscould be extracted within 4 hours with great quality，and the quantity of extracted DNA was promoted seven times compared with CTAB when Protein K dosage was 20 ng·mL-1.The optimized ISSR-PCR reaction system(20 μL)was constructed，which dosages of Mg2+，dNTPs，primer，Taq polymerase，and DNA template were 2.5 mmol·L-1，0.15 mmol·L-1，0.4 μmol·L-1，0.5 U，and 70 ng，respectively.16 primers was selected and its annealing temperature was proposed.Conclusion：Proteinase K-mCTAB is suitable for genomic DNA extraction ofI.pubescens，the reaction system，primers and its annealing temperature is stable，reproducible，and suitable for its ISSR-PCR analysis

Ilexpubescens；DNA extraction；Reaction system optimization；primer screening

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.005

2015-12-21)

国家科技支撑计划(2012BAI29B09)；公益性行业科研专项(201407002)

*

黄海波，副教授，硕士生导师，研究方向：中药品种鉴定与质量评价；Tel：(020)39358286，E-mail：2865055919@qq.com