王慧智，李会影，徐清雨，马志*

(1.牡丹江医学院 红旗医院 妇产科，黑龙江 牡丹江 157011；2.牡丹江医学院 红旗医院 儿外科，黑龙江 牡丹江 157011)

·基础研究·

紫草素抑制STAT3信号通路对人绒毛膜癌JEG-3细胞迁移和侵袭能力的影响

王慧智1，李会影1，徐清雨2，马志2*

(1.牡丹江医学院 红旗医院 妇产科，黑龙江 牡丹江 157011；2.牡丹江医学院 红旗医院 儿外科，黑龙江 牡丹江 157011)

目的：观察紫草素抑制信号传导和转录激活因子-3(STAT3)信号通路对人绒毛膜癌JEG-3细胞迁移和侵袭能力的影响，探讨其抗绒毛膜癌的可能机制。方法：体外培养JEG-3细胞，加入0.2、0.4 μg·mL-1紫草素作为实验组，阴性对照组加入等体积0.1%二甲基亚砜，甲氨蝶呤组(MTX组)作为阳性对照组加入2 μg·mL-1MTX。采用划痕修复实验、Transwell小室体外侵袭实验，观察紫草素对JEG-3细胞迁移和侵袭能力的影响。采用免疫组织化学分析STAT3和酪氨酸磷酸化STAT3(p-STAT3)阳性细胞的表达。进一步采用Real-Time PCR分析STAT3mRNA和p-STAT3mRNA的表达。结果：紫草素可显著抑制JEG-3细胞迁移和侵袭能力(P<0.05或P<0.01)，降低STAT3和p-STAT3阳性细胞的表达以及STAT3mRNA和p-STAT3mRNA的表达(P<0.05或P<0.01)。结论：紫草素能明显抑制JEG-3细胞迁移和侵袭能力，其机制可能与抑制STAT3信号通路有关。

紫草素；迁移；侵袭；信号传导和转录激活因子-3信号通路

绒毛膜癌(choriocarcinoma)也称绒毛膜上皮癌，简称绒癌，是一种来源于滋养细胞的高度恶性肿瘤，其特点是滋养细胞失去了原来的绒毛或葡萄胎的结构，而散在地侵入子宫肌层，早期即可发生血道和淋巴系统转移，导致患者迅速死亡[1]。迁移和侵袭是绒毛膜癌的重要特征，是滋养细胞肿瘤发生发展过程中的早期事件[2]。所以，研究绒毛膜癌细胞的迁移和侵袭机制必将为其治疗指明新的方向。某些转录因子调节滋养细胞的迁移和侵袭过程，可能参与了绒毛膜癌的发生和发展。信号传导和转录激活因子-3(signal transducer and activator of transcription-3，STAT3)是 JAK-STAT信号通路中一种非常关键性的转录因子，是多种致癌信号通路的汇聚点。STAT3是公认的癌基因，如乳腺癌、大肠癌等可表现为高表达[3-4]。有研究表明，紫草素可诱导人绒毛膜癌JEG-3细胞凋亡[5]，但是其是否抑制JEG-3细胞的迁移和侵袭尚未见报道。本研究旨在探讨紫草素对JEG-3细胞迁移、侵袭能力以及STAT3信号通路的影响，为明确紫草素抑制JEG-3细胞的迁移和侵袭提供实验依据，探讨其可能的作用机制，为其开发应用奠定实验基础。

1 材料

1.1 细胞株与试药

人绒毛膜癌细胞JEG-3(中国科学院动物研究所计划生育生殖生物学国家重点实验室)；DMEM培养液(美国HyClone公司)；甲氨蝶呤(MTX，美国辉瑞制药有限公司)；二甲基亚砜(DMSO)、牛血清白蛋白(BSA)、Hoechst33342(美国Sigma公司)；Transwell小室(美国Corning公司)；基质胶Matrigel(美国BD公司)；STAT3鼠单克隆抗体和酪氨酸磷酸化STAT3(p-STAT3)鼠单克隆抗体(美国ProMab公司)；HRP标记抗鼠IgG二抗(上海碧云天公司)；M-MLV逆转录试剂盒(Reverse Transcriptase kit promega，Japan)；其他试剂均为分析纯。紫草素(北京市药品检验所，溶解于0.1%二甲基亚砜，配成0.4 μg·mL-1溶液，-20 ℃保存，临用时，以DMEM培养液稀释到所需浓度)。

1.2 细胞培养

JEG-3细胞保存在含有10%BSA的DMEM培养液(含2 mmol·L-1L-谷氨酰胺，1 mmol·L-1丙酮酸钠和100 U·mL-1青霉素)，37 ℃、5% CO2及饱和湿度下培养。当JEG-3细胞达80%汇合度时，用0.05%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化。37 ℃、5% CO2及饱和湿度下培养48 h。收集悬浮的细胞经EDTA处理制备成单细胞悬液，然后用DMEM培养液洗涤细胞。收集对数生长期细胞，用于后续实验。

2 方法

2.1 划痕修复实验

JEG-3细胞按照细胞密度5×104个细胞/孔接种于6孔板中，待细胞单层生长铺满板底时，用移液枪头沿培养板底部划“一”字型划痕，加入终浓度为0.2 μg·mL-1紫草素(低剂量组)，0.4 μg·mL-1紫草素(高剂量组)[6]，37 ℃、5% CO2及饱和湿度下培养24 h。阴性对照组加入等体积0.1%DMSO，阳性对照组(MTX组)加入2 μg·mL-1MTX，其余条件与实验组完全一致。倒置显微镜下检测细胞向致伤区迁移的相对距离并拍照，计算细胞迁移率。细胞迁移率(%)=(1-药物组细胞迁移面积/对照组细胞迁移面积)×100%。每组实验重复3次，取其平均值。

2.2 Transwell小室体外侵袭实验

Transwell小室用前铺上50 μL 0.5% Matrigel膜基质37 ℃孵育过夜。JEG-3细胞加入终浓度为0.2、0.4 μg·mL-1紫草素，37 ℃、5% CO2及饱和湿度下培养24 h。阴性对照组加入等体积0.1%DMSO，MTX组加入2 μg·mL-1MTX，其余条件与实验组完全一致。调整细胞密度5×104个细胞·mL-1，分别取200 μL接种于Transwell小室内室，并在Transwell小室下室加入含有10% BSA的DMEM培养液。孵育24 h后，取出Transwell小室去除未穿膜细胞。甲醇固定15 min后，再以10 mg·mL-1Hoechst33342染色30 min[7]。OlympusIX51荧光显微镜计数穿过微孔膜的细胞数。每组细胞随机计数10个视野，取其平均值，实验重复3次。

2.3 免疫组织化学分析

JEG-3细胞胰蛋白酶消化、离心、500 μL DMEM培养液重悬。无菌乙醇洗涤，37 ℃、5% CO2及饱和湿度下过夜培养。当细胞贴在盖玻片上后更换新鲜培养液，加入终浓度为0.2、0.4 μg·mL-1紫草素，37 ℃、5% CO2及饱和湿度下培养2 h。阴性对照组加入等体积0.1%DMSO，MTX组加入2 μg·mL-1MTX，其余条件与实验组完全一致。95%乙醇固定，中性树胶粘到载玻片上，PBS洗涤3次，滴加一抗(阴性对照组以PBS代替一抗)，室温培养3 h，PBS洗涤3次。滴加HRP标记的二抗，室温培养15 min，PBS洗涤3次。滴加DAB显色剂初染，苏木素复染，中性树胶盖玻片封片，倒置显微镜镜检。结果判断标准：STAT3和p-STAT3蛋白阳性细胞均呈棕褐色阳性颗粒样物质，主要位于细胞质，胞核内可有轻度黄染。每张图片随机选取10个高倍视野，Smart scape图像分析系统对阳性染色细胞区域进行分析。

2.4 Real-Time PCR分析

JEG-3细胞加入终浓度为0.2、0.4 μg·mL-1紫草素，37 ℃、5% CO2及饱和湿度下培养24 h。阴性对照组加入等体积0.1% DMSO，MTX组加入2 μg·mL-1MTX，其余条件与实验组完全一致。按照TRIzol试剂盒说明书抽提总RNA。Nanodrop2000检测RNA纯度。使用M-MLV逆转录试剂盒进行逆转录反应成单链的cDNA，操作按照试剂盒说明书进行。利用Pubmed查找相关基因序列，并利用引物合成软件Primer Premier 5.0设计引物。STAT3正向引物：5′-CAGACGGGCATTGTGGAT-3′，反向引物：5′-AGTCTTGGGCATGTCAGTGTG-3′，共224bp；p-STAT3正向引物：5′-TTGCCAGCACAAAGACACTCC-3′，反向引物：5′-CTCCAAAGCAAACCGAATACAG-3′，共135 bp；β-actin正向引物：5′-CCAGTATGATTCTA-CCCACGGC-3′，反向引物：5′-CGGAGATGATGACC-CTTTTGGC-3′，共227 bp。使用Quant SYBR Green PCR kit按照PCR引物进行扩增，用Applied Biosystems 7500型定量PCR仪测出ΔC值及熔解曲线，计算出相对基因表达量。每份样品检测3次。

2.5 数据统计分析

3 结果

3.1 划痕修复实验结果

阴性对照组可见JEG-3细胞迁移率明显增高，而紫草素对JEG-3细胞迁移具有明显抑制作用，并呈浓度依赖性，与阴性对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；与MTX组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。以上结果提示紫草素可以抑制JEG-3细胞迁移能力。结果见图1和图2。

注：A.阴性对照组；B.低剂量组；C.高剂量组；D.MTX组。图1 紫草素对JEG-3细胞划痕修复实验结果(×100)

注：与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，下同。图2 紫草素对JEG-3细胞细胞迁移率结果

3.2 Transwell小室体外侵袭实验结果

阴性对照组可见JEG-3细胞侵袭穿膜细胞数明显增多，而紫草素对JEG-3细胞侵袭穿膜细胞数具有明显抑制作用，并呈浓度依赖性，与阴性对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；与MTX组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。以上结果提示紫草素可以抑制JEG-3细胞侵袭能力。结果见图3和图4。

注：A.阴性对照组；B.低剂量组；C.高剂量组；D.MTX组。图3 紫草素对JEG-3细胞Transwell小室体外侵袭实验结果(×200)

图4 紫草素对JEG-3细胞穿膜细胞个数结果

3.3免疫组织化学分析结果

阴性对照组表现STAT3和p-STAT3阳性细胞高表达，可见胞质内分布大量的浓密的棕褐色阳性颗粒，而紫草素可使STAT3和p-STAT3阳性细胞显著减少，可见内皮细胞胞质内棕褐色阳性颗粒减少，并且呈剂量依赖性。提示紫草素显著减少STAT3和p-STAT3阳性细胞的高表达。结果见图5。

注：A～D.STAT3免疫组织化学分析结果；E～F.p-STAT3免疫组织化学分析结果；A、E为阴性对照组；B、F为低剂量组；C、G为高剂量组；D、H为MTX组。图5 STAT3和p-STAT3免疫组织化学分析结果(×400)

3.4 Real-Time PCR分析结果

阴性对照组可见STAT3mRNA和p-STAT3mRNA呈高表达，而紫草素可使STAT3mRNA和p-STAT3mRNA显著降低，并且呈剂量依赖性，提示紫草素显著减少STAT3mRNA和p-STAT3mRNA的表达。结果见图6。

图6 STAT3 mRNA和p-STAT3 mRNA Real-Time PCR分析结果

4 讨论

紫草素是从我国传统中药天山紫草根部提取出来的萘醌色素，具有抗炎、抑制脂肪形成、抗肿瘤、调节免疫等广泛的药理作用及生物学效应[8]，其中抗肿瘤作用是目前研究的热点和重点。研究表明，紫草素对多种抗肿瘤增殖具有明显的抑制作用，如对肝癌、结肠癌、卵巢癌及绒毛膜癌等[9-12]。另有研究表明，紫草素还能够抑制非小细胞肺癌A549 细胞和人胃癌细胞SGC-7901的迁移和侵袭能力[13-14]。然而紫草素对JEG-3细胞是否具有抑制迁移和侵袭作用，目前尚不明确。本研究以不同终浓度紫草素作用于JEG-3细胞，结果发现紫草素显著抑制JEG-3细胞迁移和侵袭能力。此结果提示紫草素可作为抗绒毛膜癌的潜在性选择药物。

为了阐明紫草素抑制JEG-3细胞迁移和侵袭能力的机制，本研究对STAT3信号转导通路进行了分析。现阶段，STAT3信号转导通路在肿瘤发生和发展过程中的重要作用受到学者的高度重视。STAT3是人类恶性肿瘤中最常见且易被激活的STAT家族成员，主要介导细胞间或者细胞外信号向细胞内的转导，是一个十分重要的信号转导因子，其在肿瘤发生和恶性转变中有重要的作用，在多种实体瘤如乳腺癌、前列腺癌、胃癌和卵巢癌等中均有异常表达和活性增强，已经成为潜在的肿瘤治疗靶点[15-16]。当STAT3被上游的JAK激活后，活化形成p-STAT3，随后p-STAT3形成二聚体，进而进入细胞核，调节与癌细胞增殖、分化、迁移和侵袭等相关的靶基因转录活性[17]。Segatto等[18]报道，STAT3及其活化形式p-STAT3都会促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。本研究免疫组织化学分析结果发现，紫草素明显减少STAT3和p-STAT3阳性细胞的表达，提示其可能是抑制JEG-3细胞迁移和侵袭能力的机制。进一步采用Real-Time PCR分析STAT3mRNA和p-STAT3mRNA。结果发现，紫草素可抑制STAT3mRNA和p-STAT3mRNA的表达，结果与免疫组织化学分析相一致，进一步证实紫草素抑制JEG-3细胞迁移和侵袭能力的机制可能与抑制STAT3信号转导通路有关。

综上所述，紫草素抑制JEG-3细胞迁移和侵袭能力，抑制STAT3信号转导通路可能是其机制之一。

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EffectofShikoninonSuppressingMigrationgandInvationgofJEG-3CellsthroughInhibitingSTAT3SignalPathway

WANGHuizhi1，LIHuiying1，XUQingyu2，MAZhi2*

(1.DepartmentofObstetricsandGynecology，HongqiHospitalofMudanjiangMedicalUniversity，Mudanjiang157011，China；2.DepartmentofPediatricsurgery，HongqiHospitalofMudanjiangMedicalUniversity，Mudanjiang157011，China)

Objective：To investigate the effect of shikonin on suppressing migration and invation of JEG-3 cells through inhibiting signal transducer and activator of transcription-3(STAT3)signal pathway and discuss the possible mechanisms of anti-choriocarcinoma.Methods：JEG-3 cells were culturedinvitroand treated with shikonin at 0.2 μg·mL-1and 0.4 μg·mL-1concentrations as experimental group，the negative control group was treated with equal volume of 0.1% DMSO，MTX group(methotrexate group)was treated with 2 μg·mL-1MTX as positive control group.Wound healing assay and transwell chamber invasion assay were used to detect the effect of shikonin on migration and invasion of JEG-3 cells.Immunohistochemistry was used to detect the expression of STAT3and tyrosine phosphorylation STAT3(p-STAT3)positive cells.Real-Time PCR analysis was used to detect the expression of STAT3mRNA and p-STAT3mRNA.Results：Shikonin could inhibit migration and invasion of JEG-3 cells(P<0.05 orP<0.01)，the expression of STAT3and p-STAT3positive cells and the expression of STAT3mRNA and p-STAT3mRNA were inhibited significantly(P<0.05 orP<0.01).Conclusion：Shikonin could inhibit migration and invasion of JEG-3 cells，the mechanism may be inhibition of STAT3signal pathway.

Shikonin；migration；invasion；Signal transducer and activator of transcription-3 signal pathway

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.006

2015-07-08)

*

马志，硕士，主治医师，研究方向：儿科常见肿瘤的临床治疗；E-mail：mz13945307895@163.com