孙懂华，张影波，庞玉新，杨全，于福来，黄梅

(1.广东药学院 中药学院，广东 广州 510006；2.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南 儋州 571737；3.海南省艾纳香工程研究中心，海南 儋州 571737)

·基础研究·

基于GC指纹图谱及聚类分析评价黔琼产艾纳香质量△

孙懂华1，2，3，张影波2，3，庞玉新2，3，杨全2*，于福来2，3，黄梅2，3

(1.广东药学院 中药学院，广东 广州 510006；2.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南 儋州 571737；3.海南省艾纳香工程研究中心，海南 儋州 571737)

目的：基于指纹图谱与系统聚类分析方法对黔琼产艾纳香进行质量评价。方法：利用气相色谱法(GC)建立12个不同产地艾纳香的指纹图谱，采用相似度评价软件及 SPSS 16.0进行数据处理，对贵州和海南产地的艾纳香样品进行分析。结果：对12个产地的艾纳香进行了分析，建立了艾纳香药材气相色谱指纹图谱。S2、S6、S7的相似度在0.900以下，S3、S8、S10、S12的相似度在0.923～0.969，其他样品的相似度在0.970以上；12批样品可大致分为4类。结论：建立了艾纳香气相指纹图谱方法，该方法重复性好、简单、易行，可为艾纳香整体质量评价提供依据。

艾纳香；气相色谱指纹图谱；聚类分析

艾纳香Blumeabalsamifera(Linn.)DC，又称大风艾、大艾、冰片艾等，是菊科艾纳香属多年生草本植物，生长在热带、亚热带，耐旱喜温不耐寒，主产于我国贵州、海南、广西、广东、云南等地，是贵州罗甸县道地药材[1]。艾纳香以根、嫩枝、叶入药，其性味辛、微苦、微温，具有祛风消肿、活血散瘀之功效，可用于治疗感冒、风湿性关节炎、产后风痛、痛经，外用跌打损伤、疮疖痛肿、湿疹、皮炎[2]。现代药理学研究表明，艾纳香还具有抗氧化、抗癌和抗病毒等作用[3-5]。

艾纳香是制得艾片的原料，艾片是将艾纳香叶和嫩枝经过蒸馏设备进行蒸馏，制得艾粉，然后再纯化，但其得率较低[6]。而目前，我国天然冰片(艾片和天然冰片)市场供不应求，价格居高不下。近年来，贵州罗甸地区大面积种植艾纳香，使得该地区的土地资源匮乏问题更加凸显。为此，迫切需要拓宽艾纳香药材种植区，以满足日益扩大的市场需求。

目前对艾纳香药材的研究多集中在化学成分[7-12]及其资源种群分布[13-14]上，罕有报道其药材质量标准，仅有夏稷子等以贵产艾纳香为主要研究对象进行了GC指纹图谱研究、薄层色谱法定性研究、常规检查等[15-16]，未见涉及海南和贵州产区艾纳香指纹图谱研究的报道。基于此，为进一步合理开发艾纳香药材资源并缓解艾纳香原料供需矛盾，作者对12批采自贵州和海南的艾纳香药材进行了指纹图谱比较研究，以期为艾纳香药材在贵州道地产区外的海南广泛种植提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 7890A 气相色谱仪(配有氢火焰离子化检测器FID)，OpenLAB CDS工作站，G4513A 自动进样器。电子天平(Sartorius公司)，KQ-500DB 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 材料

左旋龙脑对照品(Alfa Aesar公司，批号：10147015，纯度≥98%，)；试剂均为国产分析纯，水为蒸馏水。艾纳香采自海南、贵州，均由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所庞玉新副研究员鉴定为菊科艾纳香属植物艾纳香Blumeabalsamifera(L.)DC.的地上叶部位。样品信息见表1。

表1 艾纳香样品来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件

其次，引导学员制定相关的阅读计划，建立读书会，鼓励学员分享阅读感受。举例而言，西点军校就设立有教务长读书俱乐部，目的是汇集不同的观点。教务长和学员一同读书。学员在读完一本书之后还要进行读书汇报。通过设立教务长读书俱乐部，西点军校引导其学员不断读书，不断读好书，为每位学员提供了分享看法与观点的平台。我们可以效仿西点军校的做法，成立世界军事名著读书俱乐部，精选世界军事名著，引导学员同步阅读，分享阅读感受。

HP-5毛细管柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)，升温程序40 ℃保持3 min，以5 ℃·min-1升温至50 ℃，以4 ℃·min-1快速升温至100 ℃，以2 ℃·min-1升温至108 ℃，以1 ℃·min-1升温至112 ℃，以4 ℃·min-1升温至120 ℃，以6 ℃·min-1升温至180 ℃，保持6 min，以5 ℃·min-1升温至220 ℃，保持10 min；FID检测器温度：240 ℃，进样口温度：240 ℃；载气：高纯氮气，流速：6.5 mL·min-1；不分流，进样量：0.6 μL。

2.2 对照品储备液的制备

取左旋龙脑对照品约10 mg，精密称定，置10 mL棕色容量瓶中，加乙酸乙酯定容，摇匀，即得质量浓度为1.012 mg·mL-1的左旋龙脑对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取艾纳香供试品约2 g，精密称定，置于10 mL具塞三角瓶中，加入乙酸乙酯10 mL，称定质量，在频率40 kHz、功率400 W的条件下超声提取20 min。放冷，称定质量，乙酸乙酯补足减失的质量，摇匀，滤过，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一供试品(样品编号：S4)，按照2.1项下方法，连续进样6次。以左旋龙脑为参照峰，计算各共有峰相对峰面积的RSD小于1.21%，相对保留时间的RSD小于0.02%，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱测定要求。

2.4.2 重复性试验 取供试品(样品编号：S4)，按照2.1项下方法平行制备6份供试品溶液，分别进样。以左旋龙脑为参照峰，计算各共有峰相对峰面积的RSD小于2.08%，相对保留时间的RSD小于0.05%，表明实验重复性良好，符合指纹图谱测定要求。

2.4.3 稳定性试验 取同一供试品溶液(样品编号：S4)，分别于0、2、4、8、12、24 h按照2.1项下方法进样分析。以左旋龙脑为参照峰，计算各共有峰相对峰面积RSD小于1.68%，相对保留时间的RSD小于0.03%，表明供试品在24 h内稳定，符合指纹图谱的要求。

2.5 样品测定

取不同产地的艾纳香药材，按2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件测定，分别得到12批样品的指纹图谱。见图1。

图1 不同产地艾纳香药材指纹图谱

2.6 指纹图谱的建立及相似度分析

以参照物峰保留时间作为1，计算其他各共有峰与参照物峰间保留时间的比值，从而得出各共有峰的相对保留时间，结果见表2和表3。将12批艾纳香色谱图采用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版”进行分析，以S1为参照图谱，采用中位数，时间窗宽度0.1，生成艾纳香药材共有模式的对照指纹图谱，标定21个共有峰，共有峰峰面积占总峰面积85%以上，见图2。12批所测供试品色谱图与对照指纹图谱相似度结果见表4。结果表明，S2、S6和S7样品的相似度小于0.900，其他批艾纳香药材样品的相似度均在0.900以上。

2.7 艾纳香药材聚类分析

运用SPSS 16.0软件对12批艾纳香药材的指纹图谱进行聚类分析。其中数据源为21个共有峰的峰面积，所有数据经过标准化处理，聚类方法采用类内平均链锁及平方欧式距离，结果见图3。根据树形图，12批样品被划分为4类，其中S2、S6和S7为一类，聚类分析所得到的样品之间的相关性，与相似度计算得到的样品之间的相关性结果较一致。

表2 12批艾纳香共有峰的相对保留时间 /min

表3 12批艾纳香共有峰的相对峰面积

注：4.左旋龙脑。图2 艾纳香药材对照指纹图谱

表4 12批艾纳香色谱图与对照指纹图谱相似度分析结果

图3 12批艾纳香样品聚类分析树状图

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

气相色谱法中常常会遇到宽沸程多组分样品难以分开的问题，而选择恒定柱温无法兼顾不同沸点组分的分离。低沸点组分由于柱温太高，色谱峰出柱过快，峰窄而相互重叠；而高沸点组分因柱温太低、出柱慢、峰宽而平，有的组分甚至不能流出。鉴于此，本实验设计了多个升温程序和不同载气流速，而以2.1项下的色谱条件所得到的色谱峰分离度较好，保留时间适中，故选择此条件。

3.2 供试品溶液的制备

分别考察了0.5、1.0、1.5、2.0 g等不同样品提取量，结果表明2.0 g的样品量效果较理想并且峰形、峰数目较为稳定。分别考察了10、20、30、60 min提取的样品，结果表明，20 min时样品的提取较充分且各色谱峰分离效果较好，响应值较大。

3.3 结果分析

中药材化学成分复杂，其内涵活性亦常有多种成分共同起作用形成，导致了全面控制中药材质量的难度很大。中药材的GC指纹图谱中各色谱峰形成“指纹图谱”的峰面积，保留时间、峰与峰间的相对比例等综合参数构成了指纹图谱。

通过本实验发现，12批黔琼产艾纳香中9批药材指纹图谱整体图与其共有模式相比相似度均达到0.90以上，因此确定了黔琼产艾纳香的指纹图谱。对艾纳香药材指纹图谱的比较发现，各产地药材指纹图谱具有基本相同的色谱峰数目，各峰相对保留时间符合程度较好，但各峰之间相对峰面积的比值相差较大，这说明艾纳香药材的各化学成分基本相同。通过对药材产地、采收期等因素进行比较可以发现，黔琼产艾纳香野生种与栽培种在相似度上未有显著差异；从以上不同采收期艾纳香药材的相似度(高于0.90)评价可以看出，黔产艾纳香采收期在11～12月与琼产艾纳香5月、9月、12月采收期相似性较高，与庞玉新等[17]研究黔琼产艾纳香主要成分含量分析结果相符。

研究人员[18]对罗甸艾纳香生长适宜气候条件和罗甸县的气候条件分析比较，发现艾纳香药材最适宜种植区主要分布在海拔400 m以下的河谷低洼地区，年平均气温20.0～20.8 ℃，最冷月均温10.3～11.0 ℃，年极端最低温度≥-1.1 ℃的保证率为80%，日平均气温≥10 ℃的活动积温6 400.3～7000 ℃·d，无霜期≥350 d，无日均温≤0 ℃的轻霜冻及日均温≤-2 ℃的重霜冻，年降雨量859.8～1 176.9 mm，年总日照时数1 227.5～1 398.8 h。与之相比，海南省属热带季风气候，是我国最具有热带海洋气候特色的地方，全年暖热，雨量充沛，干湿季节明显，年光照为1750～2650 h，光照率为50%～60%，光温充足，光合潜力高，与艾纳香最适宜种植气候条件较为接近，海南岛全年无霜冻，冬季温暖，且海南产艾纳香药材5月、9月、12月采收与黔产艾纳香具有极高的相似性，在此基础上可对海南产艾纳香年采收两次提供一定的数据支撑。此外，根据相似度和聚类分析结果还发现，贵州黎平、罗苏、望谟等地产艾纳香与道地产区罗店红水河相似性较差，分析原因可能与当地气候、土壤、海拔等因素有关。

综合以上分析结果及考虑当前贵州土地资源日益匮乏的情况，海南有着面积广阔的土地资源且符合艾纳香种植气候条件等先天优势，课题研究可在一定程度上为后期在海南儋州、琼中、白沙、五指山等地建立艾纳香的GAP种植基地以减缓贵州土地资源压力提供了理论基础。

[1] 中国科学院《中国植物志》编委会.中国植物志：第75卷[M].北京：科学出版社，1979：13，75.

[2] 中国药材公司.中国中药资源志要[M].北京：科学出版社，1994：1266.

[3] Osaki N，Koyano T，Kowithayakorn T，et al.Sesquiterpenoids and Plasmin-Inhibitory Flavonoids from Blumea b alsamifera[J].Journal of natural products，2005，68(3)：447-449.

[4] Nessa F，Ismail Z，Mohamed N，et al.Free radical-scavenging activity of organic extracts and of pure flavonoids ofBlumeabalsamiferaDC leaves[J].Food Chemistry，2004，88(2)：243-252.

[5] Noor Rain A，Khozirah S，Mohd Ridzuan M A，et al.Antiplasmodial properties of some Malaysian medicinal plants[J].Trop Biomed，2007，24(1)：29-35.

[6] 江兴龙，潘俊锋，司健，等.贵州艾纳香产地采收提取艾粉技术研究[J].生物质化学工程，2006，40(1)：17-20.

[7] 严敏，石成亮，汤洪敏.气质联用法对艾纳香中龙脑含量的测定[J].湖北农业科学，2014，53(21)：5256-5259.

[8] 卫亚丽，汤洪敏，莫珊凤，等.不同产地黔艾纳香中左旋龙脑含量测定[J].中华中医药杂志，2015，30(1)：278-280.

[9] 刘进涛，靳凤云，章誉，等.贵州罗甸艾纳香中左旋龙脑的含量测定[J].贵阳中医学院学报，2013，35(1)：16-18.

[10] 夏稷子，陈贵，安军，等.艾纳香挥发油和左旋龙脑在不同叶型及不同部位的分布[J].中成药，2014，36(8)：1719-1721.

[11] 严敏，王玉凤，汤洪敏.黔产艾纳香生物碱的提取及含量测定[J].湖北农业科学，2014，53(10)：2336-2339.

[12] 王远辉，田洪芸，何思佳，等.不同方法提取艾纳香叶挥发性成分的气相色谱-质谱分析[J].食品工业科技，2012，33(12)：97-101，105.

[13] 胡蕖，周家维.贵州省艾纳香植物资源现状及适生区区划初步研究[J].贵州林业科技，1999，27(1)：44-48.

[14] 罗夫来，王振，张云淋，等.苗药艾纳香不同居群及不同部位的质量研究[J].中国当代医药，2013，20(31)：51-53.

[15] 夏稷子，赵智，安军，等.不同产地艾纳香药材的GC指纹图谱研究[J].中国药事，2011，25(12)：1191-1194.

[16] 夏稷子，赵智，邓言欢，等.黔产艾纳香药材质量研究[J].时珍国医国药，2012，23(9)：2244-2245.

[17] 庞玉新，黄梅，于福来，等.黔琼产艾纳香中主要化学成分含量差异分析[J].广东药学院学报，2014，30(4)：448-452.

[18] 刘朝英，谭清波，顾欣.罗甸县艾纳香种植气候适宜性区划[J].贵州气象，2013，37(4)：38-40.

StudyonQualityEvaluationofBlumeabalsamiferafromHainanandGuizhouProvincebyGCFingerprintandClusterAnalysis

SUNDonghua1，2，3，ZHANGYingbo2，3，PANGYuxin2，3，YANGQuan1*，YUFulai2，3，HUANGMei2，3

(1.SchoolofTraditionalChinese，GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510006，China；2.TropicalCropsGeneticResourcesInstitute，ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences，Danzhou571737，China；3.HainanProvincialEngineeringResearchCenterforBlumeaBalsamifera，Danzhou571737，China)

Objective：GC fingerprint ofBlumeabalsamiferaand the cluster analysis were used to evaluateB.balsamiferafrom Hainan and Guizhou province.Methods：The chromatographic fingerprints ofB.balsamiferafrom 12 different origins were established by GC.“Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM” and SPSS 16.0 was applied to analyzeB.balsamiferasamples from Hainan and Guizhou province.Results：12 batches ofB.balsamiferawere analyzed，the fingerprints ofB.balsamiferafrom different areas were established.The fingerprint similarity of S2，S6，S7 was 0.711 to 0.888.The fingerprint similarity of S3，S8，S10，S12 was 0.923 to 9.969，and the samples were divided into 4 clusters by their quality difference.Conclusion：This method is reproducible，simple and easy，and can be used to provide a base for the quality control ofB.balsamifera.

Blumeabalsamifera，GC fingerprint，cluster analysis

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.009

2015-09-21)

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1630032015039)；国家自然科学基金(81374065)

*

杨全，教授，研究方向：植物类药材的规范化生产(GAP)、道地药材质量及其形成机制；Tel：(0898)23300268，E-mail：yangquan7208@vip.163.com