秦世玉,孙学成,胡承孝,谭启玲,赵小虎,李　路

(新型肥料湖北省工程实验室,华中农业大学微量元素研究中心,湖北 武汉　430070)



钼肥对甘蓝型油菜薹期碳氮代谢的影响

秦世玉,孙学成,胡承孝,谭启玲,赵小虎,李路

(新型肥料湖北省工程实验室,华中农业大学微量元素研究中心,湖北 武汉430070)

为了解钼肥施用对甘蓝型油菜薹期钼营养及叶片碳氮代谢的影响,采用盆栽试验,测定了甘蓝型油菜各个部位钼含量,叶片光合特性、色素、可溶性糖、游离氨基酸和可溶性蛋白含量。结果表明,施钼显著增加2个品种L0917和中双11(ZS11)单株鲜质量,提高幅度分别为235.50%,67.94%。施钼显著提高了ZS11叶片色素含量,L0917和ZS11叶绿素a/b值,分别降低了16.28%和10.26%,施钼提高了蒸腾速率(Tr),降低了胞间CO2浓度(Ci),对光合速率(Pn)和气孔导度(Gs)没有显著影响。同时,施钼提高了可溶性糖、游离氨基酸和可溶性蛋白含量,提高幅度分别为(L0917和ZS11)35.31%和91.38%,83.57%和274.30%,16.81%和16.02%。施钼提高了叶片硝酸还原酶(NR)的活性,L0917和ZS11提高幅度分别为211.50%,335.80%。施钼分别提高了甘蓝型油菜薹期根、茎秆和叶部位钼含量。薹期碳氮代谢研究及钼营养诊断为甘蓝型油菜花期和成熟期生殖和营养生长提供理论依据。

钼;甘蓝型油菜;薹期;碳代谢;氮代谢

油菜属于十字花科芸薹属,一年生或越年生双子叶植物,是世界五大油料作物之一,同时也是我国的传统油料作物[1]。甘蓝型油菜生长过程包括4个重要时期:苗期、薹期、花期和成熟期。薹期是甘蓝型油菜由营养生长向生殖生长中间过渡期,同时薹期具有最高的干物质积累速度,薹期过后各个器官部位元素含量出现降低现象[2]。因此,甘蓝型油菜薹期发育在整个生育期具有重要作用。

钼是植物生长必需的微量元素。虽然植物需钼量低,但是钼在植物体内扮演着重要的角色[3]。植物中有5种含钼酶,分别为硝酸还原酶(NR)、醛氧化酶(AO)、黄嘌呤脱氢酶(XDH)、亚硫酸盐氧化酶(SO)和线粒体氨肟还原酶(mARC),它们参与植物体内的碳氮硫代谢过程[4-7]。然而钼在农田土壤中的有效性受到pH、吸附氧化性、排水状况和有机化合物的影响,特别是在酸性土壤中钼的有效性降低[8]。我国南方大面积土壤呈现酸性,出现钼含量低现象[9-11],甚至严重缺钼现象[12-13]。在这些缺钼地区,又是我国油菜的主要种植区域。因此,钼肥施用对甘蓝型油菜生产具有重要意义。研究表明,甘蓝型油菜苗期对缺钼比较敏感[14-15],施钼能够促进油菜生长,增强油菜苗期光合作用强度,进而促进碳氮代谢,增加油菜的干物质积累,提高生物量和产量[16]。陈钢等[17]研究表明,施钼可以提高苗期叶片叶绿素含量、光合速率、可溶性总糖含量以及地上部干物质量和可溶性蛋白含量。同时施钼可以提高成熟期油菜产量,改善油菜籽粒品质[15,17]。而薹期则作为苗期和花期、成熟期承上启下的一个过渡期,是营养生长的旺盛时期,对花期生殖生长和成熟期果实生长具有重要的作用。但目前在钼肥施用对薹期钼吸收及碳氮代谢研究较少。因此,本试验弥补了甘蓝型油菜薹期钼营养研究的空缺,对花期和成熟期钼营养研究具有重要的现实意义。同时为甘蓝型油菜花期和成熟期钼营养诊断及合理补充钼肥提供理论依据。

1　材料和方法

1.1试验材料

油菜品种为钼高积累品种ZS11和钼低积累品种L0917。试验在华中农业大学微量元素研究中心盆栽场进行,采用米氏陶瓷钵装土6 kg。供试土壤为黄棕壤。其基本理化性质为:pH值4.88，有机质17.46 g/kg，碱解氮117.3 mg/kg，速效磷37.70 mg/kg，速效钾76.70 mg/kg,有效钼0.090 mg/kg。

1.2试验设计

采用盆栽培养法,试验设置不施钼(0 mg/kg)和施钼(0.15 mg/kg)2个钼浓度处理,以分析纯钼酸铵((NH4)6Mo7O24·4H2O)为肥源。播种前施入底肥:N 0.2 g/kg、P2O50.15 g/kg、K2O 0.2 g/kg,分别以尿素、磷酸二铵、硫酸钾为肥源(分析纯)。微量元素以1 000倍缺钼阿侬营养液加入,加入量为1 mL/kg;施钼处理以1 mg/L钼储备液加入,加入量为1 mL/kg。

油菜于2014年7月17日施底肥,混匀后放置。10月13日播种,10 d后间苗至每盆留长势一致幼苗2株,设置4次重复。2015年3月8日薹期样品收获。整个生长期用去离子水浇灌。收获当天上午测定油菜叶片(从上向下数第1片完全展开叶)光合特性指标。同时,取一整株混合叶片去离子水洗干净,冰盒保存以测定新鲜叶片色素、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、游离氨基酸含量和硝酸还原酶活性。另一株测定单株鲜质量,分根、茎秆和叶片进行杀青(105 ℃ 30 min),80 ℃烘干至恒重,磨碎测定钼含量。

1.3测定项目及方法

土壤基本理化性质采用常规分析方法测定;叶片光合参数采用便携式光合作用测定仪[16]测定净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)。叶绿素a、b及总叶绿素含量测定采用95%乙醇浸提,分光光度计法测定;可溶性多糖采用蒽酮比色法测定;游离氨基酸总量采用水合茚三酮比色法测定;可溶性蛋白采用考马斯亮蓝G-250法测定;油菜叶片硝酸还原酶活性采用离体法测定[18]。钼含量用硝酸∶高氯酸(4∶1，V/V)混合酸消化,原子吸收石墨炉法测定[19]。

1.4数据统计分析

所有数据采用Microsoft Excel 2003和SPSS 12.0软件进行方差分析,采用单因素试验统计分析LSD法(P<0.05)进行分析,SigmaPlaot 10.0软件进行绘图。

2　结果与分析

2.1施钼对甘蓝型油菜鲜质量的影响

试验结果表明,施钼显著提高了L0917和ZS11 2个品种的单株鲜质量(图1),提高幅度分别为235.50%和67.94%。其中钼低积累品种L0917在缺钼条件下鲜质量低于钼高积累品种ZS11,而在施钼条件下钼低积累品种L0917鲜质量高于ZS11。说明钼高积累品种在缺钼条件下能吸收更多的钼来满足植株生长,而钼低积累品种L0917对钼具有更高的敏感性。

不同小写字母a、b、c、d表示差异达显著水平(0.05)。图2-6同。

2.2施钼对甘蓝型油菜光合作用的影响

对于薹期光合作用(Pn)和气孔导度(Gs)2个参数,施钼有提高L0917参数值,降低ZS11参数值的趋势,但钼处理间及品种间没有达到显著差异(图2)。施钼显著降低了L0917和ZS11的胞间CO2浓度(Ci)降低幅度分别为40.3%和42.6%。相反,施钼处理提高了L0917和ZS11的蒸腾速率(Tr),分别提高了53.8%(P<0.05)和7.8%,且钼高积累品种ZS11比钼低积累品种L0917具有高的Tr和Ci。

图2　不同处理下2个品种的光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)

对于钼低积累品种L0917和钼高积累品种ZS11,施钼有提高2个品种叶绿素a含量的趋势,分别提高了2.6%和65.7%;同时显著提高了2个品种叶绿素b含量,分别提高了21.6%和84.7%(图3)。施钼降低了L0917类胡萝卜素含量,提高了ZS11类胡萝卜素含量。施钼同时降低了L0917和ZS11 叶绿素a/b值,降低幅度分别为16.28%和10.26%。说明施钼降低了叶绿素a向叶绿素b的转化。同时,在缺钼条件下,L0917具有高的色素含量,而施钼条件下,ZS11具有更高的色素含量。

图3　不同处理下2个品种色素含量

色素产生的能力在植物光合作用过程中起到重要作用。本试验中,施钼提高了ZS11叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量(P<0.05),降低了2个品种叶绿素a向叶绿素b的转化。施钼提高了Tr,降低了Ci,对Pn和Gs影响不大。说明底肥施用钼肥提高了薹期叶片色素含量同时降低了叶绿素b向叶绿素a转化及CO2的同化,从而导致光合速率差异不明显。且施钼对钼高积累品种影响更大。

2.3施钼对甘蓝型油菜可溶性糖、游离氨基酸和可溶性蛋白含量的影响

由图4可知,施钼显著提高了甘蓝型油菜叶片可溶性糖含量,L0917和ZS11提高幅度分别为35.31%和91.38%。在缺钼条件下2个品种可溶性糖含量没有差异,施钼条件下ZS11可溶性糖显著高于L0917。同样,施钼显著提高了2个品种(L0917和ZS11)游离氨基酸含量,提高幅度分别为83.57%和274.30%。且同一处理下ZS11叶片游离氨基酸含量显著高于L0917。施钼显著提高了L0917和ZS11叶片可溶性蛋白含量,提高幅度分别为16.81%和16.02%,且在施钼条件下品种ZS11具有较高的可溶性蛋白含量。

图4　不同处理下2个品种叶片可溶性糖、可溶性蛋白和游离氨基酸含量

2.4施钼对甘蓝型油菜NR活性的影响

硝酸还原酶是植物氮代谢过程中关键的含钼酶。硝酸还原酶的活性可以反映叶片氮代谢的强弱。施钼显著提高了L0917和ZS11叶片NR活性,提高幅度分别为211.50%和335.80%(图5)。相反,在缺钼条件下,L0917叶片NR是ZS11叶片NR活性的10.55倍,施钼处理下,L0917叶片NR活性是ZS11叶片NR活性的7.54倍。

图5　不同处理下2个品种叶片硝酸还原酶活性

2.5施钼对甘蓝型油菜组织钼含量的影响

施钼可以提高不同部位的钼含量(图6)。施钼分别提高2个品种(L0917和ZS11)根系部位钼含量106.9%和21.66%,茎秆钼含量45.13%和238.1%,叶片钼含量-0.72%和0.68%。与缺钼处理相比,L0917根部钼含量和ZS11茎秆钼含量在施钼处理下达到显著水平。同时在薹期，缺钼条件下L0917和ZS11根部、茎秆、叶片部位平均钼含量分别为2.957,0.657,0.661 mg/kg，施钼条件下分别为4.465,1.758,0.661 mg/kg，可以看出，无论施钼与否甘蓝型油菜根系具有最高钼含量，而施钼对叶片部位钼含量影响最小。和低积累品种L0917相比,不同处理下钼高积累品种ZS11根和茎秆部位都具有高的钼含量,叶片部位钼含量没有显著差异,这说明钼高积累品种在根系和茎秆部位积累更多的钼含量。

在薹期,施钼降低了L0917茎秆/根、叶/茎秆的钼迁移系数,降低幅度为33.85%和31.67%。施钼提高了ZS11茎秆/根值,降低了叶/茎秆值,幅度分别为191.7%和61.74%。因此,钼在茎秆向根部位迁移能力不同可能是引起2个品种钼含量差异的原因(表1)。

图6　不同处理下2个品种根(A)、茎秆(B)和叶片(C)部位钼含量

品种Cultivar处理Treatment迁移系数Translocationcoefficient茎秆/根Stalk/Root叶/茎秆Leaf/StalkL0917-Mo0.250±0.030b1.400±0.190a+Mo0.165±0.012b0.957±0.075bZS11-Mo0.220±0.024b0.804±0.067b+Mo0.641±0.153a0.308±0.145c

注:表中数值为平均值±标准误;同行中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note:Date is mean ± SE;Values followed by a different letter within a column for treatments are significantly different (P<0.05).

3　讨论

钼作为植物生长必需的微量元素,钼缺乏可以影响植物生长代谢,因此缺钼条件下施钼处理最显著的结果就是提高其生物量,并且在多种作物中得到证实[20-22]。研究表明,施用钼肥对甘蓝型油菜不同时期干质量提高幅度不同,苗期干质量积累提高幅度为4.5%～14.1%,薹期提高幅度为17.67%,成熟期提高幅度为17.81%～29.00%[23-25]。本试验中,缺钼条件下施钼对甘蓝型油菜(L0917和ZS11)薹期单株鲜质量提高幅度分别高达235.50%和67.94%。表明施钼对甘蓝型油菜生长后期影响更显著。同样,笔者也发现低积累品种L0917对钼具有更高的敏感性。

试验研究表明,缺钼可以提高叶绿素含量,增加光合速率,缺钼可以引起13个蛋白斑点变化,其中5个和光反应有关,另外5个和光合暗反应有关[26-27],说明钼和植物的光合作用有密切关系。但是,也有研究表明缺钼不影响叶绿素a和叶绿素b之间的转化[28]。这些不同的结果可能由不同的试验材料及条件引起。本试验中,施钼提高了叶绿素a和叶绿素b的含量,降低了叶绿素a向叶绿素b的转化。但施钼处理下2个品种净光合速率(Pn)没有显著改变。可能与施钼降低胞间CO2浓度(Ci)有关。先前研究也证明了钼肥施用可以降低苗期叶片Ci[16]。说明底肥施用钼肥降低Ci,从而导致甘蓝型油菜薹期Pn差异不明显。

有关研究表明,可溶性糖和游离氨基酸在油菜薹期具有最高含量,生长后期碳氮代谢大幅度减弱[29-31],因此,薹期可溶性糖含量和游离氨基酸含量能更好地反映植株生长状况。本试验中,施钼显著提高了不同品种叶片可溶性糖、游离氨基酸和可溶性蛋白含量。同时施钼提高了叶片硝酸还原酶的活性。说明施钼可以通过硝酸还原酶活性影响植物碳氮代谢作用,实现叶绿体上碳氮代谢的偶联[32]。钼的缺乏影响可溶性糖、可溶性蛋白和游离氨基酸的含量在不同作物上也得到证实[21,33-35]。因此,底肥施钼可以提高薹期可溶性糖、可溶性蛋白和游离氨基酸含量,进而提高植物的品质和逆境抗性。

前期研究表明,施钼可以增加甘蓝型油菜各个部位钼含量[25]。同样,本试验也发现施钼可以提高甘蓝型油菜薹期各组织钼含量。从试验结果可以看出,施钼不同程度提高了根、茎和叶(L0917除外)部位钼含量。且在品种L0917根部和ZS11茎秆部位达到显著差异,叶片钼含量没有显著差异,说明低钼积累品种根部储存较多的钼,具有较低的迁移能力,同时高钼积累品种茎秆部位储存较多的钼,具有较高向地上部迁移能力。由迁移系数(不同部位钼含量比值,数据未列出)及叶片部位钼含量可知,钼在油菜体内并不容易迁移,这与相关研究不一致[36],推测甘蓝型油菜对钼吸收利用能力可能受到生长时期的影响。因此,推荐薹期追施一次钼肥保障生殖生长时对肥的需求。

对于钼高低积累试材L0917和ZS11来讲,底肥施用钼可以显著促进油菜薹期的生长和代谢,包括提高了薹期鲜质量,叶片色素、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、游离氨基酸含量和硝酸还原酶活性,但薹期钼在油菜叶片部位低的浓度和体内低的迁移能力可能会影响到后期生殖生长对钼的需求。因此,推荐薹期进行钼肥追施,但钼肥追施效果有待进一步研究验证。

[1]殷艳,王汉中.我国油菜产业发展成就、问题与科技对策[J].中国农业科技导报,2012,14(4):1-7.

[2]刘晓伟,鲁剑巍,李小坤,等.直播冬油菜干物质积累及氮磷钾养分的吸收利用[J].中国农业科学,2011,44(23):4823-4832.

[3]Tejada-Jiménez M,Chamizo-Ampudia A,Galván A,et al.Molybdenum metabolism in plants[J].Metallomics :Integrated Biometal Science,2013,5(9):1191-1203.

[4]Havemeyer A,Bittner F,Wollers S,et al.Identification of the missing component in the mitochondrial benzamidoxime prodrug-converting system as a novel molybdenum enzyme[J].The Journal of Biological Chemistry,2006,281(46):34796-34802.

[5]Mendel R R,Hänsch R.molybdoenzymes and molybdenum cofactor in plants[J].Journal of Experimental Botany,2002,53(375):1689-1698.

[6]Kovács B,Puskás-Preszner A,Huzsvai L,et al.Effect of molybdenum treatment on molybdenum concentration and nitrate reduction in maize seedlings[J].Plant Physiology and Biochemistry,2015,96:38-44.

[7]武丽,张西仲,唐兴贵,等.钼胁迫对烟草含钼酶和碳氮代谢关键酶的影响[J].核农学报,2015,29(12):2385-2393.

[8]Kaiser B N,Gridley K L,Ngaire Brady J,et al.The role of molybdenum in agricultural plant production[J].Annals of Botany,2005,96(5):745-754.

[9]刘国顺,腊贵晓,李祖良,等.毕节地区植烟土壤有效态微量元素含量评价[J].中国烟草科学,2012,33(3):23-27.

[10]曹启民,赵春梅,覃姜薇,等.海南植胶区部分胶园土壤有效钼含量及其影响因素分析[J].南方农业学报,2012,43(10):1514-1517.

[11]杨绍聪,吕艳玲,杨庆华.玉溪市耕作土壤有效态微量元素含量状况[J].土壤,2001,33(2):102-105.

[12]洪松,郑泽厚,陈俊生.湖北省黄棕壤若干微量元素环境地球化学特征[J].土壤学报,2001,38(1):89-95.

[13]刘铮,唐丽华,朱其清,等.我国主要土壤中微量元素的含量与分布初步总结[J].土壤学报,1978,15(2):138-150.

[14]Liu H E,Hu C X,Hu X M,et al.Interaction of molybdenum and phosphorus supply on uptake and translocation of phosphorus and molybdenum byBrassicanapus[J].Journal of Plant Nutrition,2010,33(12):1751-1760.

[15]刘红恩,胡承孝,聂兆君,等.钼磷配合施用对甘蓝型油菜产量和子粒品质的影响[J].植物营养与肥料学报,2012,18(3):678-688.

[16]刘红恩,胡承孝,聂兆君,等.酸性黄棕壤中钼磷配施对甘蓝型油菜苗期碳氮代谢的影响[J].中国油料作物学报,2012,34(1):62-68.

[17]陈钢,年夫照,徐芳森,等.硼、钼营养对甘蓝型油菜产量和品质影响的研究[J].植物营养与肥料学报,2005,11(2):243-247.

[18]王学奎.植物生理生化实验原理和技术[M].北京:高等教育出版社,2006.

[19]Nie Z,Hu C,Liu H,et al.Differential expression of molybdenum transport and assimilation genes between two winter wheat cultivars (Triticumaestivum)[J].Plant Physiology and Biochemistry,2014,82:27-33.

[20]张木,胡承孝,孙学成,等.叶面喷施微量元素和氨基酸对小白菜产量及品质的影响[J].华中农业大学学报,2011,30(5):613-617.

[21]聂兆君,Hu C X,孙学成,等.钼对小白菜叶色、营养品质及硝酸盐含量的影响[J].中国蔬菜,2008(8):7-10.

[22]Wu S,Hu C,Tan Q,et al.Effects of molybdenum on water utilization,antioxidative defense system and osmotic-adjustment ability in winter wheat (Triticumaestivum) under drought stress[J].Plant Physiology and Biochemistry,2014,83:365-374.

[23]刘红恩.甘蓝型油菜钼磷营养互作效应及其机制研究[D].武汉:华中农业大学,2009.

[24]唐启才,赵讲芬,甘功勋.钼肥对油菜产量和品质影响的初步研究[J].贵州农业科学,1990(1):7-8.

[25]秦世玉,孙学成,胡承孝,等.钼对不同基因型甘蓝型油菜产量及钼吸收利用的影响[J].中国油料作物学报,2015,37(4):504-511.

[26]Sun X E,Tan Q L,Nie Z J,et al.Differential expression of proteins in response to molybdenum deficiency in winter wheat leaves under low-temperature stress[J].Plant Molecular Biology Reporter,2014,32(5):1057-1069.

[27]胡珍兰,张海伟,胡承孝,等.钼氮配施对烤烟光合作用及可溶性糖含量的影响[J].华北农学报,2014,29(3):199-203.

[28]喻敏,胡承孝,王运华.低温条件下钼对冬小麦叶绿素合成前体的影响[J].中国农业科学,2006,39(4):702-708.

[29]刘浩荣,宋海星,刘代平,等.油菜茎叶可溶性糖与游离氨基酸含量的动态变化[J].西北农业学报,2007,16(1):123-126.

[30]余佳玲,张力,张振华,等.油菜光合碳氮代谢特征及其与氮效率的关系[J].华北农学报,2015,30(1):219-224.

[31]袁金展,程博,马霓,等.不同熟期油菜碳氮代谢特征初步研究[J].中国油料作物学报,2015,37(2):179-184.

[32]武松伟,胡承孝,谭启玲,等.施钼对冬小麦钼高、低效品种氮代谢的影响[J].华中农业大学学报,2015,34(5):52-57.

[33]孙学成,胡承孝,谭启玲,等.施用钼肥对冬小麦游离氨基酸、可溶性蛋白质和糖含量的影响[J].华中农业大学学报,2002,21(1):40-43.

[34]朱伟堃,胡承孝,谭启玲,等.不同硝铵比下钼对小白菜产量和品质的影响[J].华中农业大学学报,2015,34(4):44-50.

[35]Ide Y,Kusano M,Oikawa A,et al.Effects of molybdenum deficiency and defects in molybdate transporter MOT1 on transcript accumulation and nitrogen/sulphur metabolism inArabidopsisthaliana[J].Journal of Experimental Botany,2011,62(4):1483-1497.

[36]Mestek O,Polak J,Juricek M,et al.Trace element distribution and species fractionation inBrassicanapusplant[J].Applied Organometallic Chemistry,2007,21(6):468-474.

Molybdenum Effect on Photosynthetic Carbon and Nitrogen Metabolism ofBrassicanapusat Bolting Stage

QIN Shiyu,SUN Xuecheng,HU Chengxiao,TAN Qiling,ZHAO Xiaohu,LI Lu

(Hubei Provincial Engineering Laboratory for New-Type Fertilizer,Microelement Research Center of Huazhong Agricultural University,Wuhan430070,China)

To investigate the effects of molybdenum (Mo) application on Mo absorption and carbon and nitrogen metabolism ofBrassicanapusat stem elongation stage,a pot experiment was conducted and the tissue Mo concentration,leaf photosynthetic parameter,leaf pigment,soluble sugar,free amino acid,and soluble protein were tested.The results showed that the fresh weight of two cultivars (L0917 and ZS11) were increased 235.50% and 67.94% with Mo application.The pigments under Mo application showed significant differences for ZS11.The Chl a/b decreased 16.28% and 10.26% for L0917 and ZS11,respectively.Mo application increased chlorophyll and transpiration rate (Tr) and decreased Chl a/b and intercellular CO2concentration (Ci).The net photosynthesis rate (Pn) and stomatal conductance (Gs) had no significant difference whether provided Mo or not.The solution sugars,free amino acids and soluble proteins increased by 35.31%,83.57%,and 16.81% for L0917 and 91.38%,274.30%,and 16.02% for ZS11,respectively.The nitrate reductase activities were also increased by 211.50% and 335.80% for L0917 and ZS11 cultivar.In addition the Mo concentrations of roots,stalks and leaves were also increased.Overall,our study presents necessity and usefulness of stem elongation stage for reproductive and vegetative growth of flowering and harvest stage.

Molybdenum;Brassicanapus;Bolting stage;Carbon metabolism;Nitrogen metabolism

2016-03-09

国家自然科学基金项目(41171240)

秦世玉(1988-),男,河南新乡人,博士,主要从事植物营养机理研究。

孙学成(1974-),男,湖北房县人,副教授,博士,主要从事植物微量元素营养研究。

S143

A

1000-7091(2016)04-0227-06

10.7668/hbnxb.2016.04.035