田莉莉,牛　良

(中国农业科学院 郑州果树研究所,河南 郑州　450009)



苹果抗ASPV病毒 RNAi载体构建及转化砧木M26的研究

田莉莉,牛良

(中国农业科学院 郑州果树研究所,河南 郑州450009)

为获得抗病毒的转基因植物新材料,采用同源重组法构建了抗苹果茎痘病毒的植物表达载体,并对苹果砧木材料M26进行了遗传转化,成功获得了转基因阳性植株。首先以感病的皇家嘎拉叶片为材料,反转录合成cDNA第一链,采用PCR方法克隆获得了489 bp的ASPV外壳蛋白基因的保守片段,通过TOPO克隆技术将该基因片段连接进入载体pENTR/SD/D,构建了入门克隆载体pEN-ASPV,再通过LR反应置换该片段连接进入目标载体pHellsgate12,构建了RNAi植物表达载体Phe-ASPV,并采用冻融法转入根癌农杆菌菌株EHA105中,获得了可用于植物遗传转化的工程菌EH-ASPV。采用农杆菌介导的方法转化苹果砧木M26叶盘,经抗生素筛选和脱菌培养获得了Kan抗性芽,进一步进行生根培养后获得了完整的Kan抗性植株,对生根植株提取总RNA后RT-PCR检测结果显示,RNAi表达载体上携带的外源基因片段(489 bp)已成功转入苹果砧木材料M26中,并在转基因植株内RNA水平上得到表达。获得的转基因新材料,为进一步通过病毒接种进行抗病性评价及抗病毒分子育种奠定了基础。

苹果茎痘病毒;CP基因;RNAi载体;遗传转化

苹果是我国果树的主栽树种之一,栽培面积和产量均居于世界之首。但是,近年来随着果树产业的迅速发展和苗木调运日益频繁,病毒病的传播日益严重。苹果茎痘病毒(Applestempittingvirus,ASPV)是一种潜隐性病毒,广泛存在于各大主要产区。树体受到侵染之后树势衰弱,并引起产量、品质等明显下降,部分植株表现为叶片反卷、木质部茎痘斑、果实凹陷等,使果树生产损失严重。目前生产上还没有较为有效的化学药剂,采用基因工程的方法培育抗病新材料,不失成为苹果抗病毒育种的有效方法。

近年来,RNA干扰(RNA interference,RNAi)[1-2]技术得到了迅速发展,利用这种高效、特异的基因沉默技术进行植物抗病毒基因工程育种的研究越来越广泛,尤其是通过RNAi沉默病毒CP基因在多种作物上获得了良好的抗病效果,但这方面的研究在苹果上的应用还不多见。本试验通过克隆苹果茎痘病毒(ASPV)外壳蛋白(Coat protein,CP)基因的保守区段,构建含该干扰片段正反向连接的RNA干扰表达载体并进行遗传转化,旨在获得抗病的转基因苹果新材料。

1　材料和方法

1.1试验材料

RNA提取所用植物试材为7年生苹果品种皇家嘎拉,转基因所用植物材料为苹果砧木M26,均取自中国农业科学院郑州果树研究所。

1.2试验方法

1.2.1目标基因片段的克隆依据NCBI在线数据库已公布的全长基因序列(Acc No.HM12156.1),选择ASPV病毒CP基因的保守区序列,设计合成引物 ASPV-F(序列为5′-CACCAGTTGCATTGATTGGGAT-3′,CACC为TOPO克隆所必需的序列接头)和ASPV-R(序列为5′-TCCAATTTTTCCCCCAGTGACT-3′)。用EASYspin 植物RNA快速提取试剂盒(北京博凌科为生物科技有限公司)从感病的苹果叶片中提取植物总RNA,紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度。取1 μg RNA,按照反转录试剂盒tansScript One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金有限公司)说明书操作,合成cDNA第1链,-20 ℃保存备用。以反转录获得的cDNA第1链为模板,用pfu DNA聚合酶(Fermentas公司)进行PCR扩增,将PCR产物切胶连接到PMD19-T vector(TaKaRa公司),委托上海生物工程技术服务有限公司进行序列测定,运用DNAMAN软件进行核苷酸序列比对分析。

1.2.2入门克隆载体的构建入门克隆载体的构建按照pENTRTM/SD/D-TOPO®TOPO Cloning Kit(美国Invitrogen公司)说明书并参照文献[3-5]进行,取1 μL含有目标基因片段的PCR回收产物(步骤1.2.1获得),构建TOPO Cloning 6 μL反应体系,25 ℃条件下反应30 min后,热激法转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(北京康为世纪生物科技有限公司),在含有50 mg/L卡那霉素(Kanamycin,Kan)的LB平板培养基上均匀涂布,37 ℃温箱培养16 h后,挑取部分单克隆至成分相同的 LB液体培养基振荡培养(37 ℃,200 r/min)14 h后,对阳性克隆用2对引物进行菌液PCR鉴定,所用引物分别为:M13-F(序列为5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′)& ASPV-R和ASPV-F&ASPV-R。阳性菌液委托上海生物工程技术服务有限公司进行测序,序列正确的阳性克隆命名为入门克隆载体pEN-ASPV。

1.2.3重组RNAi载体的构建取步骤1.2.2获得的质粒pEN-ASPV 2 μL,构建20 μL反应体系,具体按照Gateway®LR Clonase®Ⅱ Enzyme Mix(美国Invitrogen公司)说明书并参照文献进行LR反应构建RNAi载体[4-5],骨架质粒pHellsgate12由澳大利亚CSIRO公司惠赠。反应终止后用热激法将反应产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞后,在含有100 mg/L 壮观霉素(Spectinomycin,Spc)的LB平板培养基上均匀涂布,37 ℃倒置培养16 h后单克隆挑至成分相同的LB液体培养基振荡培养(200 r/min 14 h)后提取质粒,先用ASPV-F和ASPV-R作引物进行PCR扩增,再将阳性质粒分别用限制性内切酶XbaⅠ和XhoⅠ(TaKaRa产品)进行单酶切,鉴定正确的质粒命名为pHe-ASPV(图1)。将质粒pHe-ASPV用冻融交替法转化农杆菌EHA105感受态细胞(果树生物技术课题组制备)后,在添加100 mg/L Spc和50 mg/L利福平(Rif)的YEB平板培养基上均匀涂布,倒置培养48 h(28 ℃),取部分单克隆接种至成分相同的YEB液体培养基振荡培养36 h后用3对引物进行菌液PCR扩增。所用引物分别为:ASPV-F&ASPV-R,P35S-F(序列为5′-GACGCACAATCCCACTATCC-3′)& ASPV-R,NPTⅡ-F(序列为5′-ACAATCGGCTGCTCTGATG-3′) &NPTⅡ-R(序列为5′-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3′),阳性克隆命名为EH-ASPV。

图1　RNAi载体pHe-ASPV结构图

1.2.4转基因植株的获得及检测春季(4-5月)采集当年生幼嫩枝条,用流水冲洗 2～4 h,剪成约1.0～2.0 cm 长的茎段,先用75%的酒精进行表面消毒,0.1% HgCl2浸泡10 min,无菌水漂洗4～5次,接种在MS+BA 0.5 mg/L培养基上,每4～5周继代1次。取继代培养15～20 d的M26无菌苗,无菌条件下将顶部幼嫩叶片从中部划伤成部分连在一起的叶盘,在MS+BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培养基上预培养2 d,将EH-ASPV菌液28 ℃振荡培养至OD值0.5左右,离心后收集菌体,用同样体积的MS液体培养基重悬,浸泡侵染叶盘10 min后,用灭过菌的吸水纸吸干附着的菌液后,在MS+BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培养基上暗培养3 d,然后转接到MS+BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+Cef 250 mg/L培养基上,7 d后转至MS+BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+Kan 50 mg/L+Cef 250 mg/L培养基上,切取获得的抗性芽接种在MS+BA 0.5 mg/L+Kan 50 mg/L+Cef 250 mg/L培养基上,每14 d继代1次,连续继代3～4次后,发育良好的抗性芽转至1/2 MS +NAA 0.2+Kan 50 mg/L+Cef 250 mg/L培养基中。选取发育良好的生根植株(以未经转化的再生苗作对照),用1.2.1所述的方法提取植物总RNA并进行反转录合成cDNA第1链,用内参基因Actin(Acc No.GQ339778.1)上、下游引物Actin-F(序列为CTTGACTTAGCAGGTCGTGA)&Actin-R(序列为TCGTATGTGGTCTCGTGAAT)(目标片段308 bp)及干扰片段引物ASPV-F&ASPV-R进行RT-PCR扩增,1.0% 琼脂糖进行凝胶电泳。

2　结果与分析

2.1ASPV基因片段的克隆

将本试验获得的阳性克隆质粒转入PMD19-T 载体后，经测序测得的核苷酸序列长度为489 bp(图2 )。经与NCBI公布的目的基因全长序列(登录号为HM12156.1)进行同源性比对分析后，其核酸序列与全长序列(HM12156.1)的一致性为91.1%，结果表明该片段位于目的基因上。

图2　克隆获得的ASPV外壳蛋白基因片段序列

2.2入门载体pEN-ASPV的构建

TOPO 克隆反应后,阳性菌液PCR鉴定的结果显示(图3):以引物ASPV-F和ASPV-R进行PCR扩增后,电泳出现了489 bp大小的目标条带,和阳性对照扩增结果一致;而以通用引物M13F和ASPV-R进行PCR扩增后,所得片段明显大于插入的干扰片段。结果说明,通过TOPO 克隆,将靶基因片段已连接进入到pENTR/SD/D-TOPO载体。结合阳性克隆的测序结果(干扰片段部分序列与目的基因片段的碱基序列完全一致),进一步说明在本试验所构建的入门克隆载体pEN-ASPV上,其干扰片段在载体上插入的方向也是正确的。

2.3RNAi载体构建及转化农杆菌

RNAi表达载体酶切鉴定结果如图 4,重组质粒经XbaⅠ和XhoⅠ酶切后,切出的片段在大小上明显有别于空载体的酶切结果。显然，LR反应后的重组质粒酶切片段的大小约为600 bp,而未反应的空载pHellsgate12酶切出的片段则分别为1 419,1 429 bp,与预期结果相符合。这说明在所构建的RNAi载体上,干扰片段与内含子形成了正确的发卡状结构,成功完成了该载体的构建。将pHe-ASPV质粒转化农杆菌菌株EHA105后,分别用ASPV-F&ASPV-R、P35S-F&ASPV-R和NPTⅡ-F&NPTⅡ-R 3对引物进行PCR扩增后,目标条带与预期结果一致(图5),表明所构建的RNAi表达载体已成功转入农杆菌中。

M.DL2000 Marker;1.以ASPV-F&ASPV-R为引物阳性对照的PCR扩增结果;2.以M13-F&ASPV-R作引物PCR阳性克隆的PCR扩增结果;3.以ASPV-F&ASPV-R作引物阳性克隆的PCR扩增结果。

M.DL2000 Marker;1.PCR results of the positive control when using ASPV-F&ASPV-R as primers;2.PCR results of a positive clone when using primers of M13-F&ASPV-R as primers;3.PCR results of a positive clone when using ASPV-F&ASPV-R as primers.

图3入门克隆载体pEN-ASPV的PCR鉴定

Fig.3PCR identification of pEN-ASPV

A.pHe-ASPV质粒XbaⅠ酶切;B.pHe-ASPV质粒XhoⅠ酶切;M.DL2000 Marker;1.阳性克隆酶切结果,2.pHellsgate12空载酶切结果。

A.Restriction enzyme identification ofXbaⅠ;B.Restriction enzyme identification ofXhoⅠ;M.DL2000 Marker;1.Enzyme identification of a positive clone;2.Enzyme identification of the pHellsgate12 empty vector.

图4RNAi表达载体pHe-ASPV的酶切鉴定

Fig.4Identification of the RNAi vector pHe-ASPV by restriction enzyme

M.DL2000 Marker;1.ASPV-F&ASPV-R作引物的PCR产物;2.P35S-F&ASPV-R作引物的PCR产物;3.NPTⅡ-F&NPTⅡ-R作引物的PCR产物。

M.DL2000 Marker;1.PCR results of EH-ASPV when using ASPV-F&ASPV-R as primers;2.PCR results of EH-ASPV when using P35S-F&ASPV-R as primers;3.PCR results of EH-ASPV when usingNPTⅡ-F&NPTⅡ-R as primers.

图5RNAi表达载体pHe-ASPV转化根癌农杆菌EHA105阳性克隆的PCR鉴定

Fig.5PCR results of the positive clones of the transformed pHe-ASPV into theAgrobacteriumstrain of EHA105

2.4转基因植株的获得及检测

对无菌培养的M26叶盘进行转化之后(图 6-A),将经筛选和脱菌培养后获得的Kan抗性芽(图 6-B)进行生根培养,获得了生根良好的Kan抗性植株(图 6-C)。提取部分植株的总RNA进行RT-PCR检测的结果显示(图7),在以Actin-F&Actin-R作引物时,转基因植株和对照植株均能扩增出308 bp的预期片段(内参基因),而以ASPV-F&ASPV-R作引物时,对照植株(未经转化的再生苗)没有出现电泳条带,转基因植株则出现了和干扰片段大小一致(489 bp)的片段,符合预期结果。这说明位于RNAi载体上的外源基因片段,通过转化已进入苹果砧木M26中,整合到受体基因组中并在RNA水平上获得表达。

3　讨论

在我国苹果生产中,多数品种和砧木普遍带毒,其中,ASPV危害最严重的潜隐性病毒之一[6]。直接利用ASPV外壳蛋白基因转化烟草的研究前人已有报道[7],近年来，随着RNAi机理的不断阐明,其在植物抗病毒基因工程中的研究和应用也越来越受到重视[3-4,5,8-12]。

A.农杆菌侵染的M26叶盘;B.Kan抗性芽;C.Kan抗性植株。

M.DL2000 Marker;1.对照植株以Actin-F&Actin-R作引物的RT-PCR检测结果;2.对照植株以ASPV-F&ASPV-R作引物的RT-PCR检测结果;3,5,7,9,11,13.转基因植株以Actin-F&Actin-R作引物RT-PCR结果;4,6,8,10,12,14.转基因植株以ASPV-F&ASPV-R作引物RT-PCR结果。

M.DL2000 Marker;1.RT-PCR results of the control plants when usingActin-F&Actin-R as primers;2.RT-PCR results of the the control plants when using ASPV-F&ASPV-R as primers;3,5,7,9,11,13.RT-PCR results of a transformed plants when usingActin-F&Actin-R as primers;4,6,8,10,12,14.RT-PCR results of a transformed plants when using ASPV-F& ASPV-R as primers.

图7M26转基因植株RT-PCR检测的结果

Fig.7RT-PCR results of the transformed plants of the rootstock M26

通常认为,RNAi介导的病毒抗性是一种序列依赖性的基因沉默[13],其获得抗病性的主要原理是:利用植物体的RNAi机制,通过合成与病毒自身基因同源的双链RNA,对入侵病毒的遗传物质(RNA)进行特异性地切割和降解反应,从而保护植物不受危害[2]。在实际应用中,多数学者以选择病毒外壳蛋白基因最为多见[14-21]。应用这一策略,无需转化基因全长序列,只需转化部分片段就可获得抗病的转基因植株。在构建载体所用干扰片段的选择上,序列长度一般以90～1 800 bp为宜[22],序列位置可以是靶基因开放阅读框的全部或部分序列,也可以是3′或5′端的非翻译区,目前还没有固定的规则或理论依据。本试验选择了位于目的基因中后部保守区域的489 bp的基因片段,采用Gateway技术的同源重组法构建了包含靶片段的RNAi表达载体,经农杆菌介导法转入苹果砧木M26中,希望转基因植株通过发生转录后基因沉默,干涉入侵病毒的外壳蛋白合成提高抗病性。

自从1986年James等[23]采用根癌农杆菌介导的叶盘法首次获得绿袖的转基因植株以来,与其他多年生果树植物相比,苹果转基因取得了尤为突出的进展,经过近30年的研究和应用,目前在多数品种上已建立起比较成熟的叶片再生不定芽技术体系,并已在金冠、绿袖、皇家嘎拉、富士、M26等多个品种和砧木上获得了转基因植株,根癌农杆菌介导的叶盘法,也成为苹果遗传转化最重要的方法之一[24]。本试验以苹果砧木M26为试材,采用农杆菌介导法转化的近叶盘,抗性芽再生获得的植株表现为RT-PCR阳性,转化条件尚待进一步优化。但通过本研究,笔者将RNAi这一分子生物学策略应用于多年生木本植物基因工程,成功构建了RNAi载体并转入苹果砧木,为今后进行病毒抗性评价及选育抗病毒的新材料奠定了基础理论。

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Construction of Apple stem pitting virus Resistant RNAi Vector and Genetic Transformation into the Rootstock of M26

TIAN Lili,NIU Liang

(Zhengzhou Fruit Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou450009,China)

In order to develop novel disease-resistant transgenic plant materials against ASPV,a virus resistant RNAi plant expression vector was constructed by the method of homologous recombination.With theMalusrootstock of M26,genetic transformation was conducted and positive transgenic plantlets were obtained successfully.Firstly,a conserved segment of coat protein gene of ASPV (489 bp) was cloned by PCR from cDNA of the virus-infective leaves of Royal gala.Then the fragment was inserted into the vector pENTR/SD/D by TOPO cloning technology to form the intermediate vector of pEN-ASPV.After this fragment was replaced and connected into the destination vector pHellsgate12 by LR reaction,the RNAi plant expression vector Phe-ASPV was obtained.And the engineering bacteria EH-ASPV for plant transformation was obtained after the constructed RNAi vector was transformed intoAgrobacteriumstrain EHA105 by alternate freezing and thawing method.By theAgrobateriummediated method,transformation was conducted with the leaf discs of theMalusrootstock of M26.After culture and subculture for antibiotics screening,bacteria elimination and rooting,compact kanamycin resistant plantlets formed from buds were obtained.After total RNA extracted from the well rooted plantlets,RT-PCR test was conducted and the result showed that the gene fragment of 489 bp carried on the RNAi structure had been transformed into the material of M26,which was expressed in plants on the level of RNA.Through this study,novel transgenic materials were obtained successfully,which laid foundation for disease-resistance evaluation by pathogen inoculation and virus-resistant molecular breeding in the near future.

Applestempittingvirus;Coat protein gene;RNAi vector;Transgenosis

2016-03-10

国家“863”项目(2011AA100204)

田莉莉(1971-),女,河北衡水人,副研究员,博士,主要从事果树生物技术研究。

牛良(1975-),男,河南信阳人,副研究员,硕士,主要从事果树育种方面的研究。

Q78；S432.4+1

A

1000-7091(2016)04-0100-06

10.7668/hbnxb.2016.04.017