韩志顺,郑敏娜,梁秀芝

(山西省农业科学院 高寒区作物研究所,山西 大同　037008)



接种不同根瘤菌对紫花苜蓿固氮效能及生物量的影响

韩志顺,郑敏娜,梁秀芝

(山西省农业科学院 高寒区作物研究所,山西 大同037008)

为了在晋北生态区给主要推广品种筛选适宜的高效根瘤菌,使紫花苜蓿-根瘤菌共生体充分发挥共生固氮作用,建立高效、高产、优质紫花苜蓿生产体系。将中国农业科学院菌种保藏中心筛选出的9株紫花苜蓿根瘤菌作为试验材料,以山西大同地区的土壤为基质,结合温室盆栽和田间试验,比较供试材料的结瘤数、固氮酶活性、株高、生物量等指标的变化情况。筛选出适合供试材料巨能耐盐紫花苜蓿品种的4株高效根瘤菌CCBAU30015、CCBAU NMC024-1、HBU07004和CCBAU30198,并将这4株菌进行田间接种效果验证。结果表明,接种 CCBAU30015、CCBAU NMC024-1、HBU07004和CCBAU30198后,全年干草产量分别比对照增加18.7%,15.8%,11.3%和13.3%,单位面积蛋白质产量分别比对照增加10.9%,10.2%,9.7%和10.1%,其中,CCBAU30015表现最为突出,在各个指标上与对照间差异均显著(P<0.05)。说明通过土壤筛选的高效根瘤菌可以应用到实际生产中。

根瘤菌;紫花苜蓿;筛选;干草产量

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是优良的多年生豆科牧草,在悠久的栽培历史中,以其独特的作用和功能长期享有“牧草之王”的美誉[1]。它不仅具有高蛋白质、高产草量、强适应性等特点,而且还能利用其高效的固氮能力培肥地力,改善生态环境。近年来,随着我国畜牧业的发展及产业的重新布局,紫花苜蓿在农业及畜牧业中发挥的作用越来越大,是草牧业发展中首选的豆科牧草。因此,建立高效、高产、优质的紫花苜蓿生产体系,是促进现代草牧业可持续发展的关键。而建立高效、高产、优质生产体系最重要的方法之一,是给紫花苜蓿接种高效根瘤菌 (Sinorhizobiummeliloti)。国内外众多研究表明,苜蓿接种根瘤菌可以促进苜蓿早结瘤、多结瘤和增加固氮量[2],增产效果非常显著[3],该措施可以使根瘤菌-紫花苜蓿共生体从空气中固氮的总量达到 200～400 kg/hm2[4],可为生长期的紫花苜蓿提供发育所需的46%～92%的氮素[5]。目前,在美国、澳大利亚和加拿大,紫花苜蓿接种根瘤菌技术已经被普遍接受[6-7],其中,美国80%的紫花苜蓿在种植之前都会进行根瘤菌接种。

根瘤菌-苜蓿的共生固氮作用是一个非常复杂的相互作用过程,根瘤菌的固氮效率受到多个因素的影响,例如,根瘤菌基因组、宿主基因组和土壤环境因子等[8]。陈丹明等[9]、陈文新[10]的研究结果表明,在相近的生态环境条件下,同一根瘤菌可以与不同植物共生固氮;在不同的生态环境中,不同根瘤菌可以与同一植物结瘤固氮。石茂玲等[11]研究指出,在相同的土壤条件下,接种同一根瘤菌株并不能使所有苜蓿品种获得相同的接种效果,可能其中某一品种可以产生优异表现的菌株,而对其他品种则无效。Tan 等[12]和陈丹明等[9]有相似的见解,研究发现,紫花苜蓿-根瘤菌共生固氮效率涉及到寄主植物、根瘤菌和环境三者之间的互作,进行根瘤菌选种时不能只考虑与寄主的匹配性,必须要全面考虑到接种的根瘤菌与种植的生态环境及寄主植物的匹配程度。因此,为晋北生态区主要推广品种筛选合适的高效根瘤菌,使紫花苜蓿-根瘤菌共生体充分发挥共生固氮作用,避免工业肥料的盲目施用,建立高效、高产、优质生产体系具有重要意义。

本试验以山西大同地区的盐碱土壤为基质,在温室条件下对山西省北部生态区最近推广种植的紫花苜蓿品种巨能耐盐进行高效根瘤菌筛选,旨在筛选出对巨能耐盐紫花苜蓿具有最佳共生效能的根瘤菌菌株,并将筛选出的高效根瘤菌菌株进行田间小区试验进一步验证,以检验所筛选菌株的接种效果,为建立紫花苜蓿高效生产体系提供科学的试验数据和技术支撑。

1　材料和方法

1.1供试材料

1.1.1供试品种根据近年来在华北地区的品种推广及其应用现状,选择巨能耐盐紫花苜蓿品种,该品种由北京克劳沃草业有限公司提供。

1.1.2供试菌株选择9个根瘤菌菌株进行筛选试验,所有菌系的寄主植物均为紫花苜蓿,具体菌株编号及来源如表1所示。

表1　供试根瘤菌菌株编号及来源

1.2盆栽及试验地概况

1.2.1盆栽土壤来源及概况温室盆栽土壤采自山西省大同市东王庄山西省农业科学院高寒区作物研究所试验站,选择3～30 cm的耕层土壤,在取样地随机选取 5个样点,混合后采用四分法,称取2.5 kg的土壤移入花盆中。土壤类型为盐碱土,有机质14.68 g/kg,pH 值8.42,全氮0.831 g/kg,速效钾59 mg/kg,有效磷5.46 mg/kg。

1.2.2试验地概况试验地位于山西省农业科学院高寒区作物研究所试验站,东经112°34′～114°34′,北纬39°03′～40°44′,年平均降雨量为400 mm左右。试验区域土壤类型为轻壤偏沙,0～20 cm耕层土壤中含盐量为3～5 g/kg,容重为1.53 g/cm3,其余理化指标为:土壤有机质14.83 g/kg,pH值8.46,全氮0.88 g/kg,有效磷5.64 mg/kg，速效钾61 mg/kg。

1.3试验方法

1.3.1菌株的培养将菌株接种于YMA培养基培养[13],平板划线纯化,镜检纯度合格后,挑单菌落接种于YEM培养基,于28 ℃培养箱中培养72 h备用。

1.3.2种子处理及接种选择均匀饱满的苜蓿种子,先用95%乙醇和0.1%升汞各处理5 min,后用无菌水冲洗8次,再将种子置于内含无菌纱布和少量无菌水的灭菌培养皿中,在28 ℃条件下催芽36 h,待长出1 cm左右的幼根时即可种植。在无菌条件下,将种苗放入培养皿中用菌液浸泡 15 min,然后移栽于已浇透水的花盆中,每个花盆栽植25株,并将多余的菌液倒入花盆中。根据测定菌液的OD值(λ=600 nm),保证接种时每株种苗接菌量达到1.0×109个以上,以不接菌者为空白对照,每处理重复3次。

1.3.3盆栽试验设计选用9株根瘤菌菌株,以花盆为种植单位,每个处理重复 3 次。培养箱温度为25 ℃、光强 7 000～8 000 lx、光照时间 14 h,根据花盆中失水状况定期补充浇水。

1.3.4田间试验设计试验于2015年 4-9月进行,采用完全随机试验区组设计,小区面积 3 m×3 m,重复3次。采用条播,播深1.0～2.5 cm,行距25 cm。开沟播种后,将通过筛选后所得的液体菌剂施于种子周围,并覆土、镇压。

1.4观测内容及方法

1.4.1室内筛选测定指标及项目幼苗培养至45 d左右时,观测幼苗的结瘤数、固氮酶活性(采用乙炔还原法测定)、株高(测定从子叶叶痕处至最高生长点的距离),并测定地上部分干质量(以第1片子叶叶痕处作为刈割点,取样后,先将样品在烘箱中 120 ℃杀青 40 min,后于 60 ℃烘干至恒重),茎、根的含氮量(采用凯氏定氮法测定)。

1.4.2田间测定指标及项目收获前,每个小区随机选取15株植株挖根,挖土深度为30 cm,用水充分冲洗后计算根瘤数;在初花期时,选取生长均匀一致的1 m2样方收获测产,每个小区重复3次;每次收获后,取一部分样品烘干后进行粉碎,利用凯氏定氮法测定不同收获茬次的粗蛋白含量,并计算理论粗蛋白含量及产量,每个小区重复3次。

1.5数据处理

采用统计软件Excel和SPSS 18.0进行数据统计和分析。

2　结果与分析

2.1温室盆栽紫花苜蓿品种高效根瘤菌筛选

2.1.1接种不同根瘤菌菌株后植株含氮量、总含氮量和固氮酶活性的变化由表2可知,在9个供试菌株中,与对照相比,除CCBAUG275和ACCC17544外,茎含氮量均高于对照,表现较好的是HBU07004、CCBAU30015和CCBAU30198;除菌株CCBAU45236外，其余各供试菌株对根含氮量与对照间差异显著(P<0.05),在总含氮量方面,所有供试菌株均高于对照处理,表现较好的依次是CCBAU30015、HBU07004、CCBAU30198和CCBAU NMC024-1,均与对照间差异显著(P<0.05);对固氮酶活性影响较显著的菌株依次是CCBAU NMC024-1、CCBAU30015和CCBAU30198,与对照间差异显著(P<0.05)。综合4个指标,发现盆栽条件下,CCBAU30015、HBU07004、CCBAU30198和CCBAU NMC024-1这4个供试菌株的表现最好。

表2　接种不同根瘤菌后茎含氮量、根含氮量、总含氮量和固氮酶活性的变化

注:同列不同字母表示相互间差异显著 (P<0.05) 。表3-6同。

Note:In the same column,different letters mean significant difference by fisher,LSD 0.05.The same as Tab.3-6.

2.1.2接种不同根瘤菌菌株后结瘤率、地上部分株高及干物质量的变化由表3可知,在9个供试菌株中,结瘤较好的菌株依次是CCBAU30015、CCBAU NMC024-1、CCBAU30198和HBU07004,分别为96.333%,91.000%,90.333%和84.667%,与对照间差异显著(P<0.05);地上部分株高表现最好的是CCBAU30015,达到23.366cm,较对照高出71.4%,其余表现最好的几个菌株依次为CCBAU30198(20.789 cm)>HBU07004(19.621 cm)>CCBAU NMC024-1(16.898 cm);在地上干物质量方面,仅HBU07004与对照有显著差异(P<0.05),比对照增产42.5%,其余表现较好的菌株依次是CCBAU30015、CCBAU NMC024-1、CCBAU45236和CCBAU30198,分别较对照增产21.9%,20.0%,16.4%和13.9%,但差异均不显著。

综合表2,3的各项指标得出,盆栽条件最适合大同土壤的根瘤菌有CCBAU30015、HBU07004、CCBAU30198和CCBAU NMC024-1。

表3　接种不同根瘤菌结瘤率、地上部分株高和干物质量

2.2间接种根瘤菌对根瘤数的影响

从表4可以看出,接种根瘤菌后紫花苜蓿的结瘤数目均多于对照,其中,接种根瘤菌CCBAU30015的紫花苜蓿结瘤性最好,在第1茬、第2茬、第3茬与对照间均差异达显著水平(P<0.05),而接种根瘤菌CCBAU30198的紫花苜蓿结瘤个数最少,在3茬中与对照间差异不显著;从3个不同收获期的单株结瘤数对比可知,第3茬根瘤菌的数量最多,第1茬根瘤菌的数量次之,第2茬根瘤菌的数量最少。

表4　紫花苜蓿各处理不同收获时期的单株根瘤数

2.3田间接种根瘤菌对生物量的影响

2.3.1接种根瘤菌对株高、干草产量的影响由表5可知,接种根瘤菌后紫花苜蓿干草产量均明显提高,但不同茬次间提高幅度不同,表现最好的是CCBAU30015,在3茬中株高和干草产量均与对照间差异显著(P<0.05),与对照相比,第 1茬、第 2茬和第 3茬干草产量分别增加19.7%,17.7 %,19.1%;接种CCBAU NMC024-1后,第 1茬、第 2茬和第 3茬干草产量分别较对照增加16.6%,15.0%和15.9%;而接种HBU07004和CCBAU30198菌后,第1茬增产的比例低于10%,第2茬和第3茬的增产比例均在10%以上。从全年干草产量情况分析,4个菌株增产的比例分别为18.7%，15.8%，11.3%，13.3%。

4个菌株接种后,株高的变化情况与干草产量变化类似,表现最好的菌种是CCBAU30015和CCBAU NMC024-1,第1茬和第2茬的增长比例均在19%以上;而接种HBU07004 和CCBAU30198后,株高仅在第2茬时增高明显,增长率分别为13.0%和13.4%。

2.3.2接种根瘤菌对蛋白质产量的影响从表6可以看出,与对照相比,接种CCBAU30015、CCBAU NMC024-1、HBU07004和CCBAU30198等4个菌株后,全年蛋白质总产量分别增加10.9%,10.2%,9.7%和10.1%,说明接种根瘤菌能明显提高紫花苜蓿单位面积蛋白质产量。综合各项指标，认为CCBAU30015表现最为突出，在各个指标上与对照均差异显著(P<0.05)。

表5　接种根瘤菌对株高、干草产量的影响

表6　接种根瘤菌对蛋白质产量的影响

3　讨论

在自然界中,根瘤菌与豆科植物结瘤形成的共生体是最为高效的固氮体系[8]。国内外试验结果表明,豆科牧草(尤其是紫花苜蓿)接种根瘤菌,不但可以促进早结瘤、增加空气中氮素固定量,提高豆科牧草的产量和品质,而且还能改善和提高土壤肥力[2,14-16]。钟文文等[17]在四川雅安等地采集野生根瘤菌对盛世苜蓿品种进行接种,试验结果表明,Y6-1-1、BB 2-2-1-1、WZ-6-2-2 与对照相比,在占瘤率、瘤质量、总瘤数差异显著,占瘤率都在 72%以上,显著提高了植株的干质量、叶绿素含量、全氮量和产量,其中,WZ-6-2-2 的有效性最高、竞争性最强,与对照相比,鲜草产量增加了95.5%,可以用于苜蓿盛世品种的接种。马霞等[8]研究结果表明，接种根瘤菌能增加苜蓿的根瘤数量和根瘤重量苜蓿固氮率固氮量均达到了最高分别为77.8%和452.51 kg/hm2，接种根瘤菌有效促进了苜蓿的生长提高了地上部干物质积累增加了有效分枝数荚果数及种子产量种子。此外，王平等[18]在半干旱地区禾豆混播草地生物固氮作用研究中指出，紫花苜蓿接种后固氮率可增长35.5%以上。

在土壤中接种高效根瘤菌株,建立起有效的根瘤菌-苜蓿共生体系是充分发挥根瘤菌固氮潜能的前提条件。陈文新[10]研究指出,在一个地区,如果从未种植过或5年以上没有种过某种豆科植物,则土壤中很难有与该种豆科植物相匹配的根瘤菌,因此,只有筛选与品种相匹配的高效菌株进行人工接种,才能达到增产的目的。目前,在山西中北部推广种植紫花苜蓿的生产区多属没有种植过紫花苜蓿的土壤,本试验选择具有区域代表性的土壤作为紫花苜蓿共生高效根瘤菌筛选的土壤基质,旨在以自然土壤条件为筛选基质,得到能够快速应用当地土壤的高效根瘤菌菌株,所以在本试验中未对土壤进行灭菌处理。以往,在进行大田试验前,对试验用土壤提前灭菌,这使得实验室筛选的根瘤菌生长环境与自然土壤条件差异太大,以至于存在筛选的菌株竞争结瘤能力低于土著根瘤菌,使研究与生产脱节[13,19]。此外,考虑到苜蓿根瘤菌具有很强的寄主专一性[13,20],在本试验中接种的9株菌株均分离自紫花苜蓿根瘤菌。

在试验过程中,尽可能使田间土壤环境处于低氮水平,但试验结果发现,对照出现了结瘤现象,说明可能在试验土壤中存在一定数量的土著根瘤菌。对比整个试验结果可知,接种筛选高效根瘤CCBAU30015、CCBAU NMC024-1、HBU07004和CCBAU30198后的紫花苜蓿干草产量均比对照增产11.3%～18.7%,蛋白质产量比对照增加9.7%～10.9%,尤其是CCBAU30015表现最为突出,在各个指标上均与对照差异显著(P<0.05),且干草产量增加了18.7%。说明所筛选的根瘤菌竞争能力比较强,固氮效率较高,在生产中进一步确定其占瘤率后,可以考虑推广到实际生产中去。

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Effect of Rhizobium Inoculation on Nitrogen Fixation Activity and Biomass ofMedicagosativaL.

HAN Zhishun,ZHENG Minna,LIANG Xiuzhi

(Institute of the Crops in High Latitude and Cold Climate Area,Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Datong037008,China)

To select the suitable high efficient nodule bacteria in the ecological region of Shanxi to the main popularized varieties,make full use of the symbiotic nitrogen fixation of alfalfa,and to establish a high efficient,high yield,high quality alfalfa production system,nine strains were screened from the center of Microbial Resource and Application of CAAS.Soil from Datong of Shanxi Province to screen highly-effective strains for Magnum-salt (a cultivar ofMedicagosativa) in pot in greenhouse was used in this study.The number of nodules,activity of nitrogen fixing enzyme,plant height and biomass were used as test indexes.Strains of CCBAU30015,CCBAU NMC024-1,HBU07004 and CCBAU30198 were selected by this way.Experiments were conducted in field to test their inoculating responses.The results showed that compared with the uninoculated,the hay yield ofM.sativawas increased 18.7%,15.8%,11.3% and 13.3% after inoculating with the strains of CCBAU30015,CCBAU NMC024-1,HBU07004 and CCBAU30198 respectively.And the yield of crude protein (CP) was increased 10.9%,10.2%,9.7% and 10.1%,accordingly.Among the most prominent performance of CCBAU30015,the differences were significant (P<0.05).These results indicated that highly-effectiveSinorhizobiummelilotiscreened from soil andM.sativacultivar could be applied in production.

Rhizobium;MedicagosativaL.;Screening;Hay yield

2016-06-08

山西省科技攻关项目(20140311013-1);山西省回国留学人员科研资助项目(2013-135);山西省农业科学院育种基础项目(Yyzjc1403);山西省农业科学院育种工程项目(16yzgc100);山西省农业科学院高寒区作物研究所科研项目(ghs2015003)

韩志顺(1975-),女,山西大同人,助理研究员,硕士，主要从事牧草栽培及根瘤菌研究。

梁秀芝(1965-),女,山西大同人,研究员,主要从事牧草栽培及根瘤菌研究。

S551;Q939

A

1000-7091(2016)04-0214-06

10.7668/hbnxb.2016.04.033