NaCl胁迫下外源壳聚糖对菜用大豆光合作用及叶绿体活性氧代谢的影响

2016-09-23杨恒山董永义马玉露贾俊英包金花

华北农学报 2016年4期

关键词：菜用叶绿体外源

王　聪,杨恒山,董永义,马玉露,贾俊英,包金花,郑　毅

(内蒙古民族大学农学院,内蒙古通辽　028042)

NaCl胁迫下外源壳聚糖对菜用大豆光合作用及叶绿体活性氧代谢的影响

王聪,杨恒山,董永义,马玉露,贾俊英,包金花,郑毅

(内蒙古民族大学农学院,内蒙古通辽028042)

外源壳聚糖;NaCl胁迫;光合作用;叶绿体活性氧代谢

盐胁迫已成为引起植物产量和品质下降的一种主要的非生物胁迫类型,提高植物的耐盐性已成为当前亟待解决的问题。壳聚糖(Chitosan,CTS) 是脱乙酰化后得到的聚氨基葡萄糖,是一种可再生、廉价、清洁的化学物质,而且是一种有效的非生物胁迫抗性诱导剂[1～5]。研究表明,外源壳聚糖可通过提高抗坏血酸(AsA)、谷胱甘肽(GSH)等抗氧化物质的含量,有效阻止辣椒体内丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)的积累,缓解水分胁迫对辣椒幼苗造成的膜脂过氧化,增强辣椒幼苗的抗旱性[3]。盐胁迫下,壳聚糖通过提高超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性,降低MDA含量和电解质渗出率,进而促进了豇豆幼苗的形态建成[5]。高温胁迫下,外源壳聚糖显著提高了蝴蝶兰幼苗叶片SOD、POD及过氧化氢酶(CAT)活性和可溶性糖、叶绿素和类胡萝卜素含量,显著降低了质膜透性及MDA含量,进而提高了蝴蝶兰幼苗的耐热性[6]。

尽管就外源壳聚糖缓解逆境胁迫前人已做了大量研究,但壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆光合作用及叶绿体活性氧(ROS)代谢有何影响，是否可阻止/缓解盐胁迫对其造成的伤害，尚未见报道。2013年通过预备试验发现外源壳聚糖可延缓盐胁迫对菜用大豆生长的抑制作用,并筛选出了壳聚糖处理的适宜浓度为200 mg/L,在此基础上,本试验以苗期菜用大豆为研究对象,用壳聚糖溶液喷施幼苗叶片,探讨NaCl胁迫下壳聚糖对菜用大豆光合作用及叶绿体活性氧代谢的影响,旨在探明外源壳聚糖调控菜用大豆光合作用的生理机制,以期为壳聚糖作为抗盐剂的开发应用提供参考依据。

1　材料和方法

1.1植物材料准备

菜用大豆(Glycinemax(L.) Merr.)品种选用主栽品种理想高产95-1,试验于2014年4月6日在内蒙古民族大学试验基地日光温室内进行。干种子直播于上直径25 cm、下直径15 cm、高20 cm的塑料盆中,蛭石作基质,浇灌日本园试[7]营养液,每盆定苗4株。真叶展开后每3 d浇1/4浓度日本园试营养液1次,每盆浇液0.5 L。

1.2CTS诱导及NaCl处理

试验设如下处理:对照(CK):叶面喷洒清水,根部浇灌营养液;处理1 (T1):叶面喷洒CTS溶液,根部浇灌营养液;处理2 (T2):叶面喷洒清水,根部浇灌溶有NaCl的营养液;处理3 (T3):叶面喷洒CTS溶液,根部浇灌溶有NaCl的营养液。每处理10盆,3次重复。NaCl胁迫的适宜浓度为100 mmol/L[8];CTS处理的适宜浓度为200 mg/L。

2片真叶完全展开后,用手持小型喷雾器将CTS溶液均匀喷洒在幼苗叶片的正面和背面,以量足但不下滴为宜,对照和处理3喷洒清水。诱导处理5 d后进行NaCl处理,NaCl溶于1/4浓度日本园试营养液,均匀浇入处理2和处理3基质中,每3 d浇液一次,浇液量同上。对照和处理1仅浇营养液。

1.3测定项目及方法

NaCl处理0 d开始测定,以后每3 d测定一次,共测定6次。以第一片完全展开的三出复叶顶叶为测试对象。处理15 d(T2处理植株叶片出现明显褪绿、黄化症状)后测幼苗干质量。

光合参数:用GFS-3000光合仪(德国WALZ公司生产)于上午9:00-11:30测定。气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)及净光合速率(Pn)由光合测定系统直接读出。测定过程中光强约为800 μmol/(m2·s),大气温度为(25±2) ℃,大气CO2浓度为(487±10) μmol/L。每次测定重复10次。

叶绿体制备:参照孙锦[9]的方法提取,在Takeda等[10]的基础上略作改动。10 g去叶脉的新鲜叶片加20 mL提取缓冲液(50 nmol/L、pH值6.1的MES,含0.33 mol/L山梨糖醇,10 mol/L NaCl,2 mol/L MgCl2,2 mol/L EDTA,0.5 mol/L KH2PO4,2 mol/L AsA-Na,AsA-Na使用前现配现加)快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,4层纱布过滤,滤液3 300 r/min离心3 min,倒出上清液,沉淀用1 mL提取缓冲液漂洗表面悬浮物;然后用1 mL悬浮液(50 mmol/L、pH值7.6的HEPES,含0.33 mmol/L山梨糖醇,10 mmol/L NaCl,2 mmol/L MgCl2,2 mmol/L EDTA,0.5 mmol/L KH2PO4,2 mmol/L AsA-Na,AsA-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮。为保证叶绿体纯度,用Percol试剂进行梯度离心,完整率可达90%。

1.4数据处理

应用SPSS分析软件对试验数据进行统计分析。

2　结果与分析

2.1壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆干质量的影响

图1显示,NaCl胁迫15 d后,菜用大豆经T1处理后的干质量与对照无显著差异;T2处理使其干质量较对照显著降低,降幅为28%,T3处理使其干质量较T2的增幅达15%。表明NaCl胁迫显著抑制了菜用大豆干质量的增加,外源壳聚糖可缓解盐胁迫对其生长的抑制作用;无盐条件下,外源壳聚糖对菜用大豆干质量的诱导作用不显著。

不同小写字母表示差异显著(P<5%)。图2-10同。

2.2壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆光合作用的影响

2.2.1对净光合速率(Pn)的影响由图2可知,T1处理使第0,3天(喷施壳聚糖第5,8天)时的Pn显著高于对照,增幅分别为18%，30%,之后未见显著影响。T2条件下,第3天时的Pn与对照无显著差异,随着胁迫时间的延长,Pn受到了显著抑制,较对照的降幅分别达37%，45%，51%，52%;T3处理第3天时其Pn维持在T2水平,第6，9，12天时较T2显著增高,增幅分别为30%，56%，24%,至15 d时诱导作用消失,Pn又回落至T2水平。表明在NaCl胁迫和无盐条件下,外源壳聚糖对菜用大豆的Pn均产生了显著诱导作用,但无盐条件下仅在前期产生影响。上述试验结果也表明壳聚糖的作用具有时效性。

图2　壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆净光合速率(Pn)的影响

2.2.2对气孔导度(Gs)的影响图3显示,T1处理在第0,3天时的Gs均较对照显著增高;经T2处理3 d后的Gs与对照无显著差异,随后均较对照显著降低,降幅分别为14%,18%,28%,34%,T3处理并未对NaCl胁迫后的Gs产生显著影响。表明NaCl胁迫显著抑制了菜用大豆的Gs,但壳聚糖未对其产生诱导作用。

图3　壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆气孔导度(Gs)的影响

2.2.3对胞间CO2浓度(Ci)的影响T1处理后,菜用大豆在第0,3天时的Ci显著高于对照;经T2处理后第6,15天时的Ci显著高于对照,其余时期均维持在对照水平;与T2相比,T3处理第3,15天时的Ci无显著变化,其余时期均显著降低(图4)。

图4　壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆胞间CO2浓度(Ci)的影响

2.3壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆叶绿体活性氧代谢的影响

图5　壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆产生速率的影响

2.3.2H2O2含量图6显示,T1处理使0,3 d时的H2O2含量显著低于对照。T2条件下,H2O2含量在胁迫6～15 d期间均显著高于对照,T3处理使该期间的H2O2含量较T2显著降低,降幅分别为13%,13%,11%,11%,但均显著高于对照。表明外源壳聚糖可抑制NaCl胁迫下叶绿体H2O2的产生;无盐条件下,壳聚糖可显著降低菜用大豆前期的H2O2含量。

2.3.3SOD活性由图7可看出,T1处理显著提高了0 d时的SOD活性;T2处理致使整个胁迫期间的SOD活性显著下降,降幅分别为36%,16%,21%,49%,18%,T3处理显著提高了各期SOD活性,其中第6天时显著高于对照,其余时期均维持在对照水平。可见外源壳聚糖显著诱导了NaCl胁迫下菜用大豆叶绿体SOD活性;无盐条件下只对早期SOD活性产生诱导作用。

2.3.4POD活性T1处理显著提高了0,3 d时的POD活性;T2处理后,第3天时的活性未受显著影响,随后均较对照显著下降,T3处理显著提高了胁迫第6～15天期间的POD活性,其中第6,15天时达对照水平,第9,12天时显著高于对照 (图8)。

图6　壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆叶绿体H2O2含量的影响

图7　壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆叶绿体SOD活性的影响

图8　壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆叶绿体POD活性的影响

2.3.5APX活性APX可以AsA为电子供体直接清除H2O2。图9显示,T1条件下的APX活性在第0,3天时均显著高于对照;T2处理导致第6～15天期间的APX活性均较对照显著降低,T3处理使胁迫第6,9,12天时的活性较T2显著提高,但均显著低于对照。表明外源壳聚糖对胁迫中期的APX活性产生了显著诱导作用。

图9　壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆叶绿体APX活性的影响

2.3.6GR活性GR催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原形成GSH,是AsA-GSH循环的关键酶。由图10可看出,T1处理使第0,3天时的GR活性显著升高;T2处理导致整个胁迫期间的活性均显著降低;T3处理后GR活性的起伏较大,胁迫第3天时处于T2水平,之后大幅上升,第9天时达峰值,且第6,9天时的活性均显著高于对照,之后又大幅下降,但第12,15天时的活性仍显著高于T2。可见壳聚糖显著诱导了NaCl胁迫中、后期的GR活性;无盐条件下前期的GR活性受到显著诱导。

图10　壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆叶绿体GR活性的影响

3　结论与讨论

3.1NaCl胁迫下外源壳聚糖与光合参数

NaCl胁迫可通过影响叶绿素的合成、分解,光合相关酶活性,水分吸收,气孔CO2扩散阻力等生理活动以及光合器官结构等,进而直接或间接影响光合作用。植物Pn变化的原因可分为气孔因素(主要是受气孔导度的影响)和非气孔因素(受叶肉细胞光合活性的影响)。一般地,Pn、Gs和Ci均下降,则Pn的下降主要由气孔限制引起;Pn和Gs下降,Ci上升或无显著变化,则Pn的下降主要由非气孔限制引起[11～15]。而通过诱导气孔因素或非气孔因素则可能提高Pn,或阻止、缓解Pn的下降。

本试验结果显示,NaCl胁迫下,菜用大豆在胁迫第6,15天时Pn、Gs显著下降,Ci显著升高;胁迫第9、12 d时Pn、Gs显著下降,Ci无显著变化,说明非气孔限制是导致其Pn下降的主要原因。这与盐胁迫条件下黑麦草[16]、玉米[17]等的结果相近。喷施壳聚糖后,菜用大豆在胁迫第6,9,12天时均表现为Pn较盐处理显著升高,Gs无显著变化,Ci显著下降,说明壳聚糖可通过诱导非气孔因素显著缓解Pn的下降;胁迫第3,15天时的Pn、Gs、Ci均与盐处理无显著差异,前者可能是由于胁迫早期菜用大豆的光合作用未受显著影响,壳聚糖的诱导作用因此并未被激发所致,后者表明壳聚糖的作用具有时效性。可见,NaCl胁迫下外源壳聚糖可通过诱导非气孔因素来缓解菜用大豆Pn的下降,进而缓解盐胁迫对其生长的抑制作用。

3.2NaCl胁迫下外源壳聚糖与叶绿体活性氧代谢

APX、GR是AsA-GSH循环的关键酶,其活性高低可直接影响AsA、GSH的氧化、还原速率,进而影响AsA-GSH循环的运转速率及H2O2的清除效率。从本试验结果来看,外源壳聚糖使NaCl胁迫中期(6～12 d)的APX活性及胁迫中、后期(6～15 d)的GR活性显著升高。可见经外源壳聚糖诱导,NaCl胁迫下AsA-GSH循环在清除叶绿体H2O2过程中发挥了积极作用。

3.3NaCl胁迫与无盐条件下壳聚糖的诱导机制

试验结果表明,外源壳聚糖是通过激活甲壳素诱导受体激酶1(Chitin elicitor receptor kinase 1,CERK1)机理发挥作用的[20]。当植物细胞感受到几丁质时,细胞表面受体-CERK1通过其赖氨酸酸基(Lysine motif,LysM)直接与甲壳素结合(含胞外段),植物细胞膜上的CERK1通过胞外LysM结构域二聚化来完成配体感应,使其胞内结构域磷酸化并激活下游防卫反应信号通路[21]。可见,壳聚糖是通过直接作用于细胞膜系统来诱导植物防御反应的。NaCl胁迫下,植物体可通过Ca2+信号转导、SOS信号传导[22]、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联[23]等途径传导胁迫信号,进而诱导植物细胞发生一系列抗盐生理反应。外源壳聚糖在NaCl胁迫下也可能是通过直接作用于膜系统进而诱导植物体抗盐机制来发挥作用的。当菜用大豆在逆境下受到胁迫伤害时,外源壳聚糖可诱导其潜在的抗逆能力,调动抗逆协调机制,以阻止伤害或降低其伤害程度。本试验中,无盐条件下外源壳聚糖主要对菜用大豆前期光合作用及叶绿体活性氧代谢产生了显著影响,与NaCl胁迫下的作用不同,可能是其启动了不同的应答机制所致。

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Effects of Exogenous Chitosan on Photosynthesis and Chloroplast Reactive Oxygen Species Metabolism of Vegetable Soybean under NaCl Stress

WANG Cong,YANG Hengshan,DONG Yongyi,MA Yulu,JIA Junying,BAO Jinhua,ZHENG Yi

(College of Agronomy,Inner Mongolia University for Nationalities,Tongliao028042,China)