毛玉梅,李　琴,付鸣佳,金华燕,沈俊良,钟雪晴

(江西师范大学 生命科学学院,江西 南昌　330022)



蛹虫草CmKexin基因克隆和菌丝体中表达检测

毛玉梅,李琴,付鸣佳,金华燕,沈俊良,钟雪晴

(江西师范大学 生命科学学院,江西 南昌330022)

为了探讨蛹虫草类枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin-like protease)的表达特性,以真菌蛹虫草菌丝体为研究对象,通过RT-PCR获得蛹虫草CmKexin基因的ORF序列,并进行序列分析。应用Northern杂交和Real-time PCR方法,检测蓝光照射后蛹虫草菌丝体中CmKexin基因的转录情况。结果获得蛹虫草CmKexin基因的ORF序列。对翻译蛋白质产物CmKexin进行生物信息学分析,表明该蛋白质含1个属蛋白转化酶的肽酶S8家族功能域(143～429)和1个前体蛋白转化酶P功能域 (514～600),符合真菌类枯草杆菌蛋白酶的特征。蛹虫草菌丝体在黑暗预培养4 d后再蓝光照射,Northern Blotting和Real-time PCR检测均可得到相同的结果,即在持续的蓝光照射48～50 h时,出现CmKexin基因的瞬时大量转录。而其他时间内均未检测到该基因的大量转录。试验结果将为蛹虫草类枯草杆菌蛋白酶的利用提供理论依据。

蛹虫草;CmKexin基因;类枯草杆菌蛋白酶;Northern杂交;实时荧光定量PCR

枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin)为一类芽孢杆菌属(Bacillus)细菌分泌的胞外丝氨酸蛋白水解酶,在其他生物中也广泛存在类枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin-like protease)[1-5]。代表性的这类蛋白酶有人的弗林蛋白酶(Furin)[6-7]和酿酒酵母(Saccharomycescerivisiae)的Kexin蛋白[8]。其中从酿酒酵母中克隆获得的KEX2基因,其编码的蛋白质称为Kexin[8]。Kexin是一个蛋白质前体加工酶,其催化结构域与类枯草杆菌蛋白酶家族的催化结构域相似,因此也可称为类枯草杆菌蛋白酶前体蛋白转换酶(Subtilisin-like pro-protein convertases,SPCs)。它专一性地切割Lys-Arg、Arg-Arg、Pro-Arg 的C 末端肽键[8-10],参与激活肽类激素、生长因子和病毒蛋白。类枯草杆菌蛋白酶都属肽酶S8家族(Peptidase family S8)。肽酶S8家族成员含有由Asp、His和Ser出现的催化三联体,是重要的丝氨酸肽酶家族。在国际蛋白酶数据库Merops(http://merops.sanger.ac.uk/)的分类方法中,肽酶S8可以分为2个亚家族,即S8a亚家族和S8b亚家族。而来自于酿酒酵母的Kexin和人的Furin属于S8b亚家族。

在多种真菌中发现有类枯草杆菌蛋白酶,由于这类蛋白酶具有丝氨酸蛋白酶活性,可催化水解蛋白质前体而在真菌中有多方面的功能。Jacob-Wilk等[11]从栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica)中克隆了一个Kexin基因(CpKex2),分析表明该真菌的Kex2蛋白影响其发育和毒力,体现在CpKex2基因的沉默突变株减弱了它的毒力,减少了有性孢子和无性孢子的产生,这都与Kex2的酶活性有关。在栗疫病菌中还发现了另外一个类枯草杆菌蛋白酶Prb1,它也与该真菌的毒力有关,同时还影响该真菌的表型[12]。Wang等[13]对烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus)中的kexB基因(Kexin基因的另一种表示)进行了研究,该基因与该真菌的生长迟滞、温度敏感的细胞壁缺陷、分生孢子的减少和异常的极性有关。其原因是kexB基因影响N-聚糖的加工,影响MpkA依赖的细胞壁整合(Cell wall integrity,CWI)信号途径和内质网应激(ER-stress)。在米曲霉中kexB基因也影响到细胞壁中的α-1,3-葡聚糖(α-1,3-glucan)的合成[14]。在光滑念珠菌(Candidaglabrata)中,kex2基因的突变株对几种作用目标为细胞膜的抗真菌药物高度敏感[15]。也有人从真菌木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)中得到了一个可用于染料脱色的类枯草杆菌蛋白酶,该酶可加入洗衣粉中使用,显示了良好的工业生产前景[16]。目前,关于真菌中Kexin基因的研究多集中在菌丝体形成、细胞形态建成和真菌的毒力等方面的研究。

蛹虫草(CordycepsmilitarisF411)中已经发现有多种生物活性成分,目前卫生部已经批准蛹虫草为新资源食品。因此,有必要加深对蛹虫草中相关基因调控的研究。蓝光对真菌的形态发生和生理生化有重要的影响[17-21]。已确定组氨酸激酶的表达可受蓝光的影响[22]。在前期的研究中,偶然克隆获得了其中的类似Kexin基因部分片段,并在预备试验中发现其与蓝光也有一定的关系。通过探究蓝光对蛹虫草枯草杆菌蛋白酶基因表达的影响,可以为枯草杆菌蛋白酶基因在真菌中的研究提供参考依据。

1　材料和方法

1.1材料与试剂

蛹虫草菌株F411,由江西师范大学生命科学学院3411实验室保存;TRIzol试剂和第一链cDNA合成试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司;Recombinant DNase Ⅰ、pMD18-T载体和TaqDNA聚合酶为宝生物(大连)工程有限公司产品;地高辛(Dig)标记试剂盒Ⅰ和Northern杂交试剂盒为深圳莱伯克生物技术有限公司产品;尼龙膜购自美国PerkinElmer公司;SYBR Green PCR master mix购自美国Applied Biosystems公司;所有引物合成及测序均由Invitrogen公司完成。

1.2仪器与设备

S1000TMthermal cycler Chassis型 PCR扩增仪为美国伯乐(Bio-Rad)公司产品;实时荧光定量PCR仪,ABI StepOne Real-Time PCR System为美国Applied Biosystems公司产品;D-37520 Osterode型台式高速离心机为美国Thermo公司产品;DYY-12型电泳仪和DYCp31D型水平电泳槽为北京六一仪器厂产品。

1.3试验方法

1.3.1蛹虫草菌丝体的蓝光照射培养和取样蛹虫草菌丝体接种在添加1%奶粉的PDA培养基上,在24 ℃恒温培养箱中培养。先用锡铂纸包裹平板黑暗培养4 d后去除锡铂纸进行持续的蓝光光照培养,并在设定照射时间后迅速置于-80 ℃冰冻,留待以后提总RNA。预备试验已确定最长蓝光光照时间为72 h。

1.3.2蛹虫草菌丝体总RNA提取与cDNA第一链合成-80 ℃冰冻样品取出后,刮取约0.1 g菌丝体在预冷的研砵中充分研磨。按照TRIzol试剂及第一链cDNA合成试剂盒生产厂家说明书,完成菌丝体总RNA的提取与cDNA第一链的合成。

1.3.3蛹虫草CmKexin基因开放阅读框(ORF)的PCR扩增根据NCBI上查找到的相关蛹虫草基因组序列CordycepsmilitarisCM01 whole genome shotgun sequence contig247(GenBank Accession No.AEVU01000247.1)[23],开放阅读框使用软件ORF finder寻找完成,系列引物设计使用Primer 5.0和Oligo 6.0软件完成(表1)。将2 μL cDNA反转录产物加入到25 μL的PCR反应体系中。整个PCR扩增的程序为:94 ℃预变性3 min;而后94 ℃变性40 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min进行循环,共30个循环。将所获得的PCR产物进行测序。

表1　PCR扩增中的引物

1.3.4探针(Dig-DNA)制备及Northern杂交检测将提取总RNA在含有1.2%甲醛变性琼脂糖凝胶上电泳,溴化乙锭(EB)染色检测28S RNA和18S RNA的完整性。将琼脂糖凝胶上的RNA转移到尼龙膜上,而后进行预杂交、杂交、洗膜,操作过程按地高辛杂交检测试剂盒Ⅰ说明书进行,在洗膜后用碱性磷酸酶显色法检测目标条带的存在。

1.3.5蛹虫草CmKexin基因表达的Real-time检测针对Real-time PCR设计扩增CmKexin基因引物HKYA:5′-CGACGGAGACGGAAACGAG-3′和HKYB:5′-GCAAGTAAAGGAGGTGGAGGG-3′。以管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因(GenBank Accession No.FJ374269.1)[24]为内标基因,相应引物为G1:5′-GCCGAGGAAACAACAGAA-3′和G2:5′-GCAGTCGTGGCAAGGAT-3′。试验中每个样本的试验组和内参组各设3个重复,采用两步法PCR扩增程序,即95 ℃预变性20 s；而后95 ℃ 10 s和60 ℃ 30 s进行循环,共40个循环。数据处理采用ΔCT 法:

目标基因/管家基因=2-ΔCT,ΔCT=CT目标基因-CT管家基因。

2　结果与分析

2.1蛹虫草中的RNA提取

蛹虫草预先经过黑暗培养,而后再蓝光照射处理以后,培养有蛹虫草菌丝体的培养皿迅速置于-80 ℃,以保证在每次取样时光照处理时间的准确。从图1中可以看出所获得的总RNA有2条清晰的28S和18S条带,质量较好。

2.2蛹虫草CmKexin基因ORF的分段克隆测序和推测蛋白质序列分析

2.2.1蛹虫草CmKexin基因ORF序列分析共获得了CmKexin基因ORF序列中的5段序列,即KX1为550 bp,KX2为650 bp,KX3为600 bp,KX4为1 200 bp,KX5为450 bp,这与设计片段长度一致(图2)。利用DNAman软件将上述序列拼接,获得蛹虫草CmKexin基因的ORF序列,全长为2 562 bp。Blast结果表明所获得的CmKexin基因的ORF与C.militarisCM01 contig247序列中8 156～10 717 bp处同源。将获得的CmKexin基因的ORF序列呈送NCBI,获得GenBank Accession No.KC182793.1。

图1　蛹虫草菌丝体中提取的总RNA

M.Marker;1.由引物KXe1U 和KXe1D 扩增的KX1;2.由引物KXe2U和KXe2D扩增的KX2;3.由引物KXe3U和 KXe3D扩增的KX3;4.由引物KXe4U和KXe4D 扩增的KX4；5.由引物KXe5U和KXe5D 扩增的KX5。

M.Marker;1.PCR product KX1 amplified with KXe1U and KXe1D;2.PCR product KX2 amplified with KXe2U and KXe2D;3.PCR product KX3 amplified with KXe3U and KXe3D;4.PCR product KX4 amplified with KXe4U and KXe4D;5.PCR product KX5 amplified with KXe5U and KXe5D.

图2蛹虫草CmKexin基因ORF中部分序列的PCR产物电泳图

Fig.2Electrophoresis of PCR products fromCmKexingene ORF partial sequence inC.militaris

2.2.2推测蛹虫草CmKexin基因表达产物氨基酸序列分析使用DNAStar editseq的Translate功能,得到CmKexin基因翻译产物CmKexin的推测氨基酸序列,长度为853 aa(GenBank Accession No.AGF91875.1)。运用NCBI的CDD数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)对该蛋白质结构域进行分析,在CmKexin中包含1个属于蛋白转化酶的肽酶S8家族功能域(Peptidase S8 family domain in Protein convertases)(143～429)、1个前体蛋白转化酶P功能域(Proprotein convertase P-domain)(514～600)和3个Ca2+结合位点。因此，推测此蛋白为类Kexin蛋白酶。

在CmKexin的肽酶S8家族功能域中,包含3个保守活性位点,分别是天冬氨酸(Asp)(185)、组氨酸(His)(223)和丝氨酸(Ser)(395)活性位点。另外，还有3个与蛋白质热稳定性有关的Ca2+结合位点。CmKexin的催化结构域与Kexin/Furin蛋白酶的催化结构域相似,表明具有相似的功能。蛹虫草CmKexin中含有保守的前体蛋白转化酶P结构域,有证据表明该结构域主要参与调节催化结构域的活性[25-26]。

2.2.3CmKexin蛋白质的功能结构域序列分析利用DNAman 软件,将CmKexin的肽酶S8家族结构域和原蛋白转化酶P结构域分别与5种真菌,即酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(NCBI Reference Sequnce NP_014161.1)、球孢白僵菌(Beauveriabassiana)(GenBank Accession No.EJP61353.1)、绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)(GenBank Accession No.EFY99205.1)、川地曲霉(Aspergilluskawachii)(GenBank Accession No.GAA81939.1)和麦角菌(Clavicepspurpurea)(GenBank Accession No.CCE32137.1)、1种细菌噬菌蛭弧菌Bdellovibriobacteriovorus(NCBI Reference Sequnce NP_967370.1)和1种动物小家鼠(Musmusculus,GenBank Accession No.CAA37988.1)中的类枯草杆菌蛋白酶中的相同功能域进行比对。

比对结果表明,CmKexin与这7种生物类枯草杆菌蛋白酶中的肽酶S8家族结构域和原蛋白转化酶P结构域有较高的同源性,尤其是与真菌的同源性要高于与动物和细菌的同源性(表2、图3)。在真菌中,CmKexin的这2个结构域与同为虫生真菌的球孢白僵菌的同源性最高。从CmKexin肽酶S8家族结构域中可清楚看到含Asp、His和Ser残基3个高度保守的区域,且除细菌稍有差异外,均出现在基序Asp-Asp-Gly、His-Gly-Thr-Arg 和Gly-Thr-Ser-Ala中(图3)。根据分析结果可以确定Cmkexin为属于丝氨酸蛋白酶S8b亚家族的蛋白转化酶,其序列结构与国际蛋白酶数据库Merops(http://merops.sanger.ac.uk/)中的相关描述一致。

2.3蛹虫草中CmKexin基因蓝光诱导表达的Northern杂交检测

2.3.1用于Northern杂交的探针合成CmKexin基因部分序列构建在质粒载体pMD18-T上,以该质粒为底物,以KX1和KX4C为扩增引物,通过地高辛(Dig)标记试剂盒Ⅰ进行探针的合成。在特异性PCR扩增后,产物经电泳检测到一条865 bp DNA条带(图4)。这样目标DNA条带标记上地高辛,将该DNA片段回收作为Northern杂交用的探针。

表2　CmKexin与不同物种间类枯草蛋白酶功能域的同源性

2.3.2CmKexin基因蓝光诱导表达的Northern杂交检测蛹虫草菌丝体在黑暗中预培养4 d后快速放入蓝光中照射处理。通过Northern杂交可以初步确定黑暗48,96 h的取样中未见有杂交带(图5-1,8);进入蓝光以后,光照1,4,8,12,24 h也均未检测到杂交带(图5-7,6,5,4,3),只有光照48 h时才出现了1条杂交条带(图5-2)。

2.4蛹虫草CmKexin基因表达的Real-time PCR检测分析

根据2.3.2的试验结果,设计Real-time PCR检测蓝光对CmKexin基因表达的影响。结果表明,当黑暗4 d(即进入蓝光照射之前)CmKexin基因的相对表达量不是很明显,进入蓝光照射以后稍有一点下降,并维持在一个相对平稳的低水平(图6)。但从蓝光照射的第48 h开始,CmKexin基因相对表达量有一个急剧的上升,并在第50 h达到了最高峰,而在56 h又回到原有水平(图6)。这样的结果和2.3.2的试验结果相比较基本是一致的,这2个结果可互为印证。

3　讨论

蛹虫草中含有丰富的对人体有益的活性物质,已经成为卫生部批准的新资源食品。因此,弄清楚蛹虫草中的生理生化活性成分非常重要。前期对蛹虫草中的部分基因进行克隆的过程中,获得了类似Kexin基因部分片段,预备试验中发现其与蓝光有一定的关系。在前期研究基础上对该基因进行了克隆和测序,获得类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶基因CmKexin。

A.肽酶S8家族结构域比对;B.前体蛋白转化酶P结构域比对。

图4　标记探针的电泳检测结果

1.黑暗48 h;2.蓝光处理48 h;3.蓝光处理24 h;4.蓝光处理12 h;5.蓝光处理8 h;6.蓝光处理4 h;7.蓝光处理1 h;8.黑暗96 h。

1.Darkness treatment of 48 h;2.Blue light treatment of 48 h;3.Blue light treatment of 24 h;4.Blue light treatment of 12 h;5.Blue light treatment of 8 h;6.Blue light treatment of 4 h;7.Blue light treatment of 1 h;8.Darkness treatment of 96 h.

图5蛹虫草受蓝光照射后CmKexin基因的Northern Blotting

Fig.5Northern Blotting analysis ofCmKexingene ofC.militarisin the continuous blue light irradiation

图6　蓝光处理后蛹虫草中CmKexin基因表达的Real-time PCR检测

通过PCR克隆了CmKexin基因的ORF序列,翻译后可得到的蛋白质CmKexin氨基酸序列长853 aa。在CmKexin中包含1个肽酶S8家族功能域和1个前体蛋白转化酶P功能域,与酵母的Kexin蛋白有较高的同源性,也与其他真菌中类枯草杆菌蛋白酶这2个功能域有较高的同源性,初步表明CmKexin属于S8b亚家族的前体蛋白转化酶。CmKexin的催化结构域中带有明显的Asp、His和Ser残基的保守序列,可形成催化三联体结构,该特点在其他真菌的丝氨酸蛋白酶中也有出现[27]。

通过Northern 杂交检测,CmKexin基因在蓝光照射48 h时有较好的表达,而在其他时间段均没有检测到该基因的表达。通过实时荧光定量PCR对蓝光照射处理后的蛹虫草CmKexin基因表达进一步研究,无蓝光照射和蓝光照射的前48 h内没有检测到CmKexin基因的表达,只在48 h后表达量急剧上升,并在50 h时达顶峰。该结果和Northern杂交检测的结果基本一致,剔除人为因素的影响,这2个结果没有太大出入。已经初步确知CmKexin基因的产物为类枯草杆菌蛋白酶,而类枯草杆菌蛋白酶与某些初生蛋白质合成过程中的成熟有关[7]。因此,推测在该时间段蛹虫草中有一类蛋白质的合成和成熟,并可能在成熟过程中主要由CmKexin基因的表达产物来加工。此外,已经有研究表明某些真菌中的类枯草杆菌蛋白酶对一些真菌的菌丝体生长有抑制作用[28-30]。在研究中,观察到蛹虫草在蓝光照射48 h以后,其菌丝体的生长开始变得缓慢,此时正是CmKexin基因的大量表达以后,相关结果还需要更多的研究结果进行支持。

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Clone of Gene CmKexin of Cordyceps militaris and Its Detection of Expression in Mycelium

MAO Yumei,LI Qin,FU Mingjia,JIN Huayan,SHEN Junliang,ZHONG Xueqing

(College of Life Sciences,Jiangxi Normal University,Nanchang330022,China)

In order to study the characteristics of subtilisin-like protease expression in the mycelia of fungusCordycepsmilitaris,CmKexingene ORF sequences ofC.militariswas got by RT-PCR,thenCmKexinsequence was analysed.The Real-time PCR and Northern Blotting were used to theCmKexingene expression analysis in theC.militarismycelia in blue light irradiation of different time.Results showed theCmKexingene ORF sequence was obtained fromC.militarismycelia.The bioinformatics analysis for the translation products ofCmKexingene showed that there were 1 peptidase S8 family domain of protein convertases (143-429) and 1 proprotein convertase P-domain(514-600) in the protein.The two domains existed in CmKexin demonstrate the characteristics of subtilisin-like protease.Under the dark pre-culture in 96 h,a large amounts of transcript ofCmKexingene in the mycelia could be detected by Northern Blotting and Real-time PCR in the continuous blue light irradiation to 48-50 hours.But the transcription ofCmKexingene wasn′t detected in the other time ofC.militarismycelia culture.These results would provide the basis for using the subtilisin-like protease inCordycepsmilitaris.

Cordycepsmilitaris;CmKexingene;Subtilisin-like protease;Northern Blotting;Real-time PCR

2016-04-26

国家自然科学基金项目(31060004;31260010)

毛玉梅(1989-),女,山东聊城人,在读硕士,主要从事食用菌分子生物学研究。毛玉梅、李琴为同等贡献作者。

付鸣佳(1964-),男,江西高安人,博士,教授,硕士生导师,主要从事食药用真菌研究。

Q939.5;Q556+.3;Q78

A

1000-7091(2016)04-0112-07

10.7668/hbnxb.2016.04.019