韩　磊,迟胜起,张剑峰

(青岛农业大学 农学与植物保护学院,山东 青岛　266109)



番茄褪绿病毒CP基因克隆、序列分析及原核表达

韩磊,迟胜起,张剑峰

(青岛农业大学 农学与植物保护学院,山东 青岛266109)

为制备番茄褪绿病毒(Tomatochlorosisvirus,ToCV)抗血清,以番茄病叶为试验材料,提取总RNA,根据ToCVCP基因设计特异性引物,利用RT-PCR方法克隆目的基因,构建原核表达载体pET32a-ToCVCP,在大肠杆菌Rosetta (DE3)菌株中表达CP蛋白。结果表明:ToCVCP基因(GenBank登录号:KT809400)全长774 bp,编码257个氨基酸,与GenBank中其他地区分离物核苷酸序列同源性为97.2%～99.6%,推导的氨基酸序列同源性为97.3%～100.0%。核苷酸序列保守位点占全部位点的91.3%,氨基酸序列保守位点占全部位点的88.3%,表明不同地理来源的番茄褪绿病毒的CP基因保守性较高。将ToCVCP基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)上,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白。SDS-PAGE分析表明,转 pET32a-ToCVCP载体的大肠杆菌Rosetta (DE3)菌株表达了分子量约33 kDa的重组蛋白。该重组蛋白在37 ℃,1.0 mmol/L IPTG、诱导6 h,表达量最大。

番茄褪绿病毒;外壳蛋白基因;原核表达;基因克隆

番茄褪绿病毒(Tomatochlorosisvirus,ToCV)往往能引起番茄老叶叶片黄化,叶边缘区域轻微卷曲,新生叶片起初没有症状,但随着病害的发展,叶脉间逐渐坏死,叶片变脆[1]。番茄褪绿病毒病发病初期与某些缺素症状相似,往往被认为是营养失调所致。1998年,该病毒在美国佛罗里达州首次发现[2],2004年在我国台湾首次发现并报道了ToCV[3],随后在国内多个省市的温室番茄植株上检测出了ToCV的发生[4-7]。

番茄褪绿病毒属于长线形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒属(Crinivirus),其基因组为正义单链RNA分子,5′端有甲基化帽子结构,3′端无Ploy(A)尾巴[8]。……