魏利洁,苏建辉,轩淑欣,王彦华,申书兴,赵建军

(河北农业大学 园艺学院,河北省蔬菜种质创新与利用重点实验室,河北 保定　071001)



大白菜单拷贝序列的长片段PCR体系优化

魏利洁,苏建辉,轩淑欣,王彦华,申书兴,赵建军

(河北农业大学 园艺学院,河北省蔬菜种质创新与利用重点实验室,河北 保定071001)

目的序列长片段PCR产物可作为FISH技术的有效探针进行分子细胞遗传学研究。然而,传统PCR技术对于5 kb以上的长片段进行有效扩增很难。合适的反应条件及反应体系是进行长片段PCR有效扩增的必要前提。为了获得目的序列长片段PCR产物以用于FISH研究,根据大白菜A03染色体顶端无重复序列区段设计了80对长片段PCR引物,从基因组DNA模板质量、dNTPs浓度以及退火温度和延伸时间方面对PCR技术体系进行了优化。试验证明,选用幼苗嫩叶的基因组DNA和LATaqDNA聚合酶可以提高长片段PCR引物的扩增质量和扩增效率;确定了适合5～15 kb长片段PCR的反应体系为20 μL:50 ng/μL模板DNA 2 μL,2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL,10 μmol/μL正反引物各1 μL,10× LA PCR Buffer Ⅱ(含Mg2+) 2 μL,5 U/μL LATaq酶0.2 μL;反应条件为98 ℃变性15 s;58～64 ℃退火10 s,68 ℃延伸5 min,35个循环；68 ℃延伸10 min,4 ℃保存。在大白菜基因组中成功获得了60对5～15 kb的扩增片段。为在大白菜粗线期染色体上开展长片段PCR-FISH技术研究及在近缘种间开展比较染色体涂染揭示进化关系奠定了理论基础。

大白菜;长片段PCR;体系优化;单拷贝序列

染色体涂染(Chromosome painting,CP)是利用染色体或染色体区段特异性DNA文库作为探针池在中期染色体或粗线期染色体进行FISH(Fluorescenceinsituhybridization)可视化作图的技术,在染色体鉴定、结构重排、染色体畸形诊断和物种进化研究中扮演了重要角色[1-3]。……