魏利洁,苏建辉,轩淑欣,王彦华,申书兴,赵建军

(河北农业大学 园艺学院,河北省蔬菜种质创新与利用重点实验室,河北 保定　071001)



大白菜单拷贝序列的长片段PCR体系优化

魏利洁,苏建辉,轩淑欣,王彦华,申书兴,赵建军

(河北农业大学 园艺学院,河北省蔬菜种质创新与利用重点实验室,河北 保定071001)

目的序列长片段PCR产物可作为FISH技术的有效探针进行分子细胞遗传学研究。然而,传统PCR技术对于5 kb以上的长片段进行有效扩增很难。合适的反应条件及反应体系是进行长片段PCR有效扩增的必要前提。为了获得目的序列长片段PCR产物以用于FISH研究,根据大白菜A03染色体顶端无重复序列区段设计了80对长片段PCR引物,从基因组DNA模板质量、dNTPs浓度以及退火温度和延伸时间方面对PCR技术体系进行了优化。试验证明,选用幼苗嫩叶的基因组DNA和LATaqDNA聚合酶可以提高长片段PCR引物的扩增质量和扩增效率;确定了适合5～15 kb长片段PCR的反应体系为20 μL:50 ng/μL模板DNA 2 μL,2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL,10 μmol/μL正反引物各1 μL,10× LA PCR Buffer Ⅱ(含Mg2+) 2 μL,5 U/μL LATaq酶0.2 μL;反应条件为98 ℃变性15 s;58～64 ℃退火10 s,68 ℃延伸5 min,35个循环；68 ℃延伸10 min,4 ℃保存。在大白菜基因组中成功获得了60对5～15 kb的扩增片段。为在大白菜粗线期染色体上开展长片段PCR-FISH技术研究及在近缘种间开展比较染色体涂染揭示进化关系奠定了理论基础。

大白菜;长片段PCR;体系优化;单拷贝序列

染色体涂染(Chromosome painting,CP)是利用染色体或染色体区段特异性DNA文库作为探针池在中期染色体或粗线期染色体进行FISH(Fluorescenceinsituhybridization)可视化作图的技术,在染色体鉴定、结构重排、染色体畸形诊断和物种进化研究中扮演了重要角色[1-3]。随着分子生物学技术的发展,人们发展了多种方法来制备染色体涂染探针,如通过流式细胞分拣或显微解剖的染色体获得[4-5]、或平行扩增寡核苷酸探针文库获得[6-7]、或筛选无重复序列的毗邻BAC克隆(BACs)获得[8-10]。由于高等植物含有较高的重复序列,以流式细胞分拣或显微解剖获得的染色体DNA探针没有取得较好的效果[11-12],而寡核苷酸探针在植物上的应用效果尚有待证实,大量无重复序列BACs的筛选工作量较大。Lou等[13]利用PCR扩增无重复序列的单拷贝基因,以扩增产物构成单拷贝基因池在黄瓜染色体上进行涂染获得成功。染色体涂染结果表明,2～15 kb的扩增探针可以被成功检测,扩增片段越长,检测效率越高。这一结果为已测序植物上如何获得染色体涂染探针进而开展相关研究提供了参考。

近几年发展起来的长片段PCR(Long range PCR,LR-PCR)技术能快速、特异地扩增目的基因或较大的DNA片段,并已用于基因克隆、基因组作图、DNA测序、连续重叠区(Contig)的构建、基因突变分析以及单倍型分析等诸多领域[14-17]。理论上,常规PCR可以得到5.0 kb以上的PCR产物,但在实际的操作过程中很难稳定得到扩增片段,这就给利用单基因拷贝探针进行染色体涂染带来一定困难。根据不同的试验需要对PCR方法进行优化和改进也正在不断地发展,利用扩增长片段的LATaq酶,结合使用GC Buffer I,以及热启动PCR技术和两步法扩增出了大小为16.5 kb的全长稻瘟病抗性基因Pi36[18]。采用巢式PCR或和降落PCR相结合的方法进行了基因FMNL2编码区全长及FMNL2-NT、CT的扩增[19]。通过直接测序长片段PCR产物开发一种新型PKD1基因突变筛查检测[20]。前人根据不同的试验需要对长片段PCR方法进行优化和改进,表明引物设计、模板质量、DNA聚合酶、dNTP浓度、热启动和退火、延伸温度等因素不同程度的影响和限制着长片段的扩增结果。

为了开展芸薹属A、C基因组比较染色体涂染研究,鉴定大白菜—结球甘蓝渐渗系中外源片段的渗入情况,本试验以大白菜自交系85-1基因组DNA为模板,利用根据大白菜A03染色体序列设计的引物进行扩增,通过研究PCR反应体系中模板DNA质量、dNTPs浓度、聚合酶种类和反应程序中退火温度、延伸温度对扩增效果的影响,拟建立适合长片段扩增的PCR技术体系,旨在为大白菜染色体涂染技术体系的建立提供探针依据。

1　材料和方法

1.1试验材料

供试植物材料:大白菜自交系85-1。供试试剂:6×Loading Buffer、DNA Marker、LATaqDNA聚合酶(5 U/μL)、dNTP(2.5 mmol/L)、2×GC Buffer(含25 mmol/L Mg2+)均购自TaKaRa公司;琼脂糖购自于上海GENE TECH公司。

1.2试验方法

1.2.1基因组DNA提取与检测采用改良的CTAB法[21]提取大白菜85-1 5～6片苗期和开花期嫩叶基因组DNA,采用0.7%的琼脂糖凝胶检测基因组DNA的质量,采用紫外分光光度计测定其浓度。

1.2.2引物设计与合成基于白菜基因组网站(http://brassicadb.org/brad/)A03染色体的序列数据资料,利用在线软件Repeatmarker排除重复DNA序列区段,利用Primer 5.0软件从A03染色体顶端至170 kb区段随机设计引物80对,引物长度20～23 bp,预期扩增长度5～17 kb,引物相关信息见表1,引物由上海生物工程技术有限公司合成。

1.2.3PCR扩增和检测PCR基本反应体系20 μL,包含:50 ng/μL模板DNA 2 μL,2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL,10 μmol/μL正反引物各1 μL,10× LA PCR Buffer Ⅱ(含Mg2+)2 μL,5 U/μL LATaq酶 0.2 μL,剩余体积用灭菌水补齐。其中对dNTPs的使用量分别进行了0.125，0.150，0.200，0.250，0.300，0.350 mmol/L的调整。

PCR的基本扩增程序参照Lou等[13]进行:98 ℃变性15 s；60 ℃退火10 s,68 ℃延伸5 min,共计35个循环；68 ℃延伸10 min,4 ℃保存。根据引物序列不同对退火温度进行58,60,62,64 ℃和延伸时间进行3,4,5 min的调整。

反应结束后,取5 μL PCR扩增产物与1 μL 6×Loading Buffer混合,点样于1%琼脂糖凝胶(含0.05%的Goldview)点样孔中,在电压100 V恒压的条件下,电泳40 min后检测。

表1　引物信息

2　结果与分析

2.1基因组DNA质量检测及对PCR扩增效果影响

模板的完整性和浓度是LR-PCR扩增质量的关键因素,只有高质量的DNA模板,才能扩增出理想的带谱。对不同时期的嫩叶采用改良CTAB法提取基因组DNA(gDNA),琼脂糖凝胶检测结果表明:用苗期幼叶提取的gDNA约为23 kb,条带清晰、完整,基本无降解,纯度高;开花期嫩叶提取的gDNA也在23 kb左右,但条带较弱,浓度低,且泳道中存在大量的降解DNA(图1-A)。

将提取的gDNA浓度调整到50 ng/μL,以其为模板,利用引物A03Ⅱ-9按基本反应体系和基本反应程序进行PCR扩增,检测结果表明:以苗期幼叶gDNA为模板,引物A03Ⅱ-9扩增出了1条长度大于5 kb的特异条带,而以开花期幼叶gDNA为模板,扩增的条带弱,特异性差,且为非目的条带。因此相比较而言,苗期幼叶提取的gDNA较适用于LR-PCR(图1-B)。

A.提取的gDNA检测图:M.λHind Ⅲ Marker;1～4.苗期幼叶gDNA;5～6.开花期幼叶gDNA。

2.2dNTPs浓度和延伸时间对长片段PCR扩增的影响

随机选取不同预期扩增长度的6对引物A03Ⅶ-4、A03Ⅷ-3、A03Ⅶ-12、A03Ⅶ-8、A03Ⅶ-10和A03Ⅶ-1,预期扩增片段长度分别为6 983,7 425,8 702,9 770,11 550,14 996 bp,对反应体系中dNTPs的浓度和反应程序中延伸时间进行了梯度设置,在退火温度为60 ℃时进行试验。

试验结果表明,当dNTPs浓度为0.150～0.200 mmol/L,延伸时间为3 min时,A03Ⅶ-4、A03Ⅷ-3和A03Ⅶ-12分别扩增出了预期大小的DNA片段(图2-A);当dNTPs使浓度为0.150～0.200 mmol/L,延伸时间延长为4 min时,A03Ⅶ-8和A03Ⅶ-10分别扩增出了预期大小的DNA片段(图2-B、D),当延伸时间延长为5 min时,A03Ⅶ-1扩增出了预期大小的DNA片段(图2-C、E);而dNTPs的浓度为0.300,0.350 mmol/L时在不同的延伸时间6对引物的扩增效果不如浓度为0.200 mmol/L好,并且延伸时间为5 min时扩增效率最高(图2-F)。

M.λ-EcoT14Ⅰdigest Marker;1.A03Ⅶ-4;2.A03Ⅷ-3;3.A03Ⅶ-12;4.A03Ⅶ-8;5.A03Ⅶ-10;6.A03Ⅶ-1.

2.3长片段引物的初筛

根据以上试验结果得出,在PCR反应体系其他成分不变的情况下,采用0.200 mmol/L的dNTPs使用量,反应程序采用60 ℃的退火温度和5 min的延伸时间,对设计的80对引物进行PCR扩增。结果表明,55对成功扩增出了预期大小的DNA片段,条带清晰,长度为5～15 kb(表2),部分引物初筛琼脂糖检测结果如图3所示。

表2　60 ℃退火温度下可获得扩增产物的引物

1.A03Ⅶ-1;2.A03Ⅶ-2;3.A03Ⅶ-4;4.A03Ⅶ-5;5.A03Ⅶ-6;6.A03Ⅶ-7;7.A03Ⅶ-8;8.A03Ⅶ-9;9.A03Ⅶ-10;10.A03Ⅶ-11;11.A03Ⅶ-12;12.A03Ⅷ-1;13.A03Ⅷ-2;14.A03Ⅷ-3;15.A03Ⅸ-1;16.A03Ⅸ-2;M.λ-EcoT14Ⅰdigest Marker.

2.4退火温度梯度设置对扩增产物的影响

对于60 ℃退火温度下没有扩增出产物的26对引物,通过在58～64 ℃内设置连续退火温度,对85-1基因组DNA进行了进一步扩增。

结果表明,有5对引物扩增出了预期大小的DNA片段,其中,2对引物A03Ⅳ-3和A03Ⅶ-8在退火温度为58 ℃时分别获得了预期大小为11,9 kb的扩增产物;3对引物A03Ⅱ-13、A03Ⅲ-9和A03Ⅳ-5均在退火温度为64 ℃时得了预期大小为12～13 kb的扩增产物(图4)。

1.A03Ⅱ-13;2.A03Ⅲ-9;3.A03Ⅳ-5;M.λ-EcoT14Ⅰdigest Marker.

3　讨论

一般来说,普通的PCR技术通常情况下只能扩增5 kb以内的短片段。和普通的PCR技术相比来看,LR-PCR技术有很多难点,因为随着扩增片段的延长,扩增效率也会随之降低,在长片段PCR过程中,其DNA分子的变性比短片段困难;高温会降低缓冲液的缓冲能力,从而损害模板DNA和PCR产物;且高温下其他二价离子的存在会促进DNA的裂解;再者,DNA聚合酶与模板DNA的趋近和结合变得困难;错配碱基的掺入导致DNA聚合酶的作用不能正常发挥,从而限制产物的长度;长片段扩增常常受到非特异短片段优先扩增的影响等问题。

因此，为了提高长片段产物扩增效率,在反应体系和反应程序中,参考大多文献,笔者采取了以下优化措施:首先,模板在LR-PCR中起着决定性作用,较长的模板DNA中有更多位点容易在变性步骤中发生脱嘌呤和脱氨,所以长片段PCR中使用的要求是完整的DNA模板[15,21]。试验证明用苗期幼叶为材料比开花期幼叶所提取的DNA条带不容易降解,而且在DNA提取过程中,要注意操作轻柔,避免剧烈振荡,以确保DNA的完整性;其次是调整反应体系,以适合扩增5～15 kb片段。在dNTPs用量上,在PCR反应中,dNTPs是为其提供原料的,所以较长目的片段可能需要较多的dNTPs;从原理上讲是作为DNA合成的原料,片段越长需要的dNTPs越多,而且多数文献中dNTPs采用浓度为0.35 mmol/L[21],本试验中对dNTPs浓度进行了0.125～0.350 mmol/L的梯度设置,表明dNTPs浓度0.200 mmol/L(1.6 μL)时就可以获得预期的片段长度;反应程序中,由于长片段PCR的扩增对退火温度的反应特别敏感,笔者根据引物Tm值及预期片段长度,并参考Lou等[13]LR-PCR程序中采用的退火温度60 ℃,选择60 ℃为退火温度,然后为了获得较好的扩增效率,对退火温度进行了梯度设置,发现在60 ℃时扩增效率最高,对没有扩增出产物的引物,选用其他退火温度,可获得的引物只有5对,扩增效率不高说明退火温度不是主要原因,可能与引物设计有关;另外,LR-PCR要保证链延伸足够长,必须要保证足够的链延伸时间和校对酶活性,在本试验中证明采取延长延伸时间(5 min)时扩增效率最好。

通过调整PCR反应体系和反应程序,本试验成功地获得了60对长度为5～15 kb的PCR产物,为长片段探针在大白菜染色体涂染技术中的应用奠定了基础。

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Optimization of Long-range PCR System Based on Single Copy Sequences of Chinese Cabbage

WEI Lijie,SU Jianhui,XUAN Shuxin,WANG Yanhua,SHEN Shuxing,ZHAO Jianjun

(College of Horticulture,Hebei Agricultural University,Key Laboratory for Vegetable Germplasm Enhancement and Utilization of Hebei,Baoding071001,China)

The products obtained by long range PCR based on objective sequences were the effective probes for FISH to carry out molecular cytogenetic study.However,it is very difficult to amplify more than 5 kb-long fragments effectively by traditional PCR techniques.Suitable reaction conditions and reaction system are the necessary prerequisite for running effective LR-PCR amplification.In order to obtain LR-PCR products based on the objective sequences as FISH probes,80 pairs of LR-PCR primers were designed based on the sequences of repeat-free regions on the top of Chinese cabbage chromosome A03,and PCR technique system was optimized from the following aspects containing the template quality of Chinese cabbage genomic DNA,dNTPs concentration,annealing temperature and extended time.Results indicated that genomic DNA of seedling leaves and LATaqpolymerase enzyme could improve the amplification quality and efficiency of long-range PCR.And 5-15 kb PCR products could be amplified by the reaction system with 20 μL of total volume,comprising of 50 ng/μL DNA 2 μL,2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL,10 μmol/μL of each primer 1 μL,10× LA PCR Buffer Ⅱ (including Mg2+) 2 μL,5 U/μL LATaqenzyme 0.2 μL.PCR reaction procedure was followed as:98 ℃ for 15 s;58-64 ℃ for 10 s,68 ℃ for 5 min,35 cycles;final extension at 68 ℃ for 10 min kept at 4 ℃.Under these conditions,60 fragments with 5-15 kb length were obtained from Chinese cabbage genome.This research would establish the basis for carrying out long range PCR-FISH on meiotic pachytene chromosomes of Chinese cabbage and for clarifying evolutionary by comparing chromosome painting among close related species.

Chinese cabbage;Long range PCR(LR-PCR);System optimization;Single copy sequences

2016-05-12

国家自然科学基金项目(31501758;31171964);农业部杰出人才培养计划项目(2130106);“十二五”农村领域国家科技计划项目(2012AA100202-5);河北省百人计划项目(No.E2013100011);河北省科技计划项目(16226304D)

魏利洁(1988-),女,河北邯郸人,硕士,主要从事蔬菜育种研究。

赵建军(1971-),男,河北沧州人,研究员，博士,博士生导师,主要从事蔬菜生物技术与遗传育种研究。

轩淑欣(1977-),女,河北保定人,副研究员,博士，硕士生导师,主要从事分子细胞遗传与育种研究。

Q78;S634.03

A

1000-7091(2016)04-0051-06

10.7668/hbnxb.2016.04.009