袁金海,刘自刚1,,孙万仓1,,曾秀存,马　骊,方　园,刘海卿,郭仁迪,王治江,陈　奇,王凯音,刘林波

(1.甘肃省油菜工程技术研究中心,甘肃 兰州　730070;2.甘肃农业大学 农学院,甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室,甘肃省干旱生境作物学重点实验室,甘肃 兰州　730070;3.河西学院 农业与生物技术学院,甘肃 张掖　734000)



白菜型冬油菜叶片质外体蛋白提取及响应低温胁迫的蛋白表达分析

袁金海2,刘自刚1,2,孙万仓1,2,曾秀存1,3,马骊2,方园2,刘海卿2,郭仁迪2,王治江2,陈奇2,王凯音2,刘林波2

(1.甘肃省油菜工程技术研究中心,甘肃 兰州730070;2.甘肃农业大学 农学院,甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室,甘肃省干旱生境作物学重点实验室,甘肃 兰州730070;3.河西学院 农业与生物技术学院,甘肃 张掖734000)

为了研究质外体蛋白在低温胁迫下白菜型冬油菜抗寒的作用机理,以陇油7号五叶期叶片为试材,采用2种不同提取液(提取液A:0.1 mol/L pH值=7.6 Tris-HCl、0.2 mol/L KCl、1 mmol/L PMSF,提取液B:0.05 mol/L pH值=7.6 Tris-HCl、0.01 mol/L EDTA-Na2、0.02 mol/L Vc、1 mmol/L PMSF)进行质外体蛋白提取效果比较。结果表明:提取液A的蛋白提取率达到了(0.073±0.004 6)mg/g,比提取液B提高了42.88%;经六磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)活性检测,提取液A提取的蛋白质污染率较提取液B低0.91%;双向电泳第一向等电聚焦IEF中,提取液A提取的蛋白质不仅除盐时间较提取液B短4.5 h,且获得的凝胶图谱清晰;通过丰度计算,得到陇油7号低温胁迫(4 ℃,48 h)后具有显著差异的蛋白点339个,其中表达量变化在2倍以上的蛋白点为46个,包括上调表达蛋白点18个,下调表达蛋白点21个,特异性表达蛋白点7个,推测这些差异蛋白点可能与低温胁迫有关。对特异表达的7个蛋白点进行质谱分析鉴定,得到与低温胁迫相关的蛋白,为白菜型冬油菜超强抗寒品种陇油7号抗寒相关分子机理的研究奠定了基础理论。

质外体;陇油7号;蛋白;双向电泳

植物的质外体由细胞壁、细胞壁间隙中的液相和气相空间组成,其主要组成部分是细胞壁。它是一个动态空间,其内包括许多重要的生理生化过程,如维持细胞内环境的动态平衡、信号的传导、光合和呼吸代谢的气体交换及抵御逆境胁迫等[1]。当植物体遭受不良环境的胁迫时,作为植物体的第一道天然屏障-质外体,为了响应逆境胁迫,从而激发质外体信号系统的表达,同时质外体作为植物细胞之间物质交换与能量转换的通道,在整个植物体生长发育中起着重要的作用[2]。目前对植物质外体蛋白的研究主要集中在模式植物拟南芥上[3],另外在水稻[4]、燕麦[5]、小麦[6]、葡萄[7]、鹰嘴豆[8]等农作物上也有所涉及。Zhang等[9]以水为缓冲液提取了水稻幼苗根部质外体蛋白,经双向电泳凝胶图谱分析,仅得到了100个左右的蛋白点；陈颖等[10]以醋酸钠为缓冲液,提取了杨树茎段质外体蛋白,凝胶结果显示,蛋白斑点主要分布在低分子量、酸性区域；孙万仓等[11]用EDTA-Na2作为提取液研究出了白菜型冬油菜根质外体抗冻蛋白的提取方法,经前期试验发现该方法并不适合于白菜型冬油菜叶片质外体蛋白的提取。我国北方寒旱区冬寒春旱,而白菜型冬油菜是该地区唯一能够安全越冬的冬油菜类型。目前,对于白菜型冬油菜叶片质外体蛋白的研究鲜见报道。因此,研究质外体蛋白质对明确其在低温胁迫反应中的响应机制及冬油菜的抗寒机理具有重要意义。本试验对提取白菜型冬油菜叶片质外体蛋白质的方法及低温胁迫前后差异蛋白的表达进行了研究,以期为寻找和鉴定一些与低温胁迫密切相关的蛋白质提供理论依据。

1　材料和方法

1.1植物材料

以超强抗寒白菜型冬油菜品种陇油7号为供试材料。

1.2缓冲液

提取液A:0.1 mol/L pH值=7.6 Tris-HCl、0.2 mol/L KCl、1 mmol/L PMSF，提取液B:0.05 mol/L pH值=7.6 Tris-HCl、0.01 mol/L EDTA-Na2、0.02 mol/L Vc、1 mmol/L PMSF。

1.3试验设计

选取籽粒饱满、大小一致的油菜种子,用10%过氧化氢处理30 min后,用无菌水冲洗2～3次,置于铺有2层滤纸的培养皿内进行催芽(光照14 h,30 ℃,黑暗10 h,28 ℃),相对湿度70%,待种子露白后,播种于装有育苗基质的花盆(14 cm×13 cm)中,每盆4株幼苗,于人工培养箱中培养(培养条件为:光照14 h,25 ℃,黑暗10 h,20 ℃),待幼苗长至五叶期时,将材料分为2份,一份继续在上述条件下生长,作为对照(CK),另一份于光照14 h,4 ℃,黑暗10 h,4 ℃条件下进行低温胁迫处理,连续处理48 h后,取样,3 次重复。

1.4测定方法

1.4.1总蛋白的提取总蛋白提取采用TCA-丙酮沉淀法[12-14]。

1.4.2质外体蛋白的提取质外体蛋白的提取参照Smallwood等[15]和Zhu等[16]的提取方法(略改进)。

①称取10 g新鲜油菜叶片,用预冷的ddH2O冲洗2次,滤纸吸干表面水分后,切成1 cm左右的长条,装入锥形瓶,加入足够预冷的提取缓冲液,抽真空到35 kPa[17],15 min后将压强恢复到正常大气压水平,期间振荡3～4次,直至材料完全下沉;②倒掉缓冲液,用滤纸吸干叶片表面的溶液后,将其放入30 mL注射器内,再将注射器放入50 mL离心管中,4 ℃,7 000 r/min离心20 min,收集离心管底部液体,即粗提液;③在粗提液中加入5倍体积预冷的丙酮,-20 ℃ 沉淀10～20 h,4 ℃,10 000 r/min离心30 min,倾去丙酮,用100%,80%的甲醇各洗涤1次,沉淀在-20 ℃挥发,获得冻干的蛋白质样品。

1.4.3蛋白含量的测定Bradford[18]法测定蛋白质浓度,用牛血清蛋白做标准曲线,在UV-1600紫外分光光度计下测定595 nm处的OD值,根据标准曲线方程计算样品蛋白浓度。

1.4.4G6PDH活性检测参照陈颖等[10]的方法,通过测定细胞内六磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)活性来检测质外体蛋白的污染率。

1.4.5蛋白质双向电泳第1向等点聚焦(IEF)使用17 cm的IPG胶条,按照GE Healthcare双向电泳操作手册操作,样品上样量为900 μg[19],将样品与水化液按体积比1∶4混匀,总体积为500 μL,按表1 程序进行,第2向采用浓度为12% 丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳,电泳结束经考马斯亮蓝染色、脱色后通过UMAX的Powerlook 2100XL扫描采集图像,用PDQuest 8.0 分析软件对凝胶图谱标准化处理,蛋白质点匹配和检测。

表1　等电聚焦电泳程序

1.4.6差异蛋白点的质谱鉴定对差异表达蛋白点回收、酶解[20],送往上海中科新生命生物科技有限公司进行质谱鉴定(MALDI-TOF-TOF MS)和数据库检索。

2　结果与分析

2.1两种提取液对质外体蛋白质提取效率及污染率的影响

从图1 可以看出,用KCl和EDTA-Na2作为缓冲液,蛋白质提取率分别为(0.073±0.004 6),(0.042±0.000 9) mg/g,与EDTA-Na2相比,KCl蛋白提取率提高了42.88%,提取效果更加明显;由图2可以看出KCl和EDTA-Na2蛋白提取液污染率分别为1.34%,2.25%,KCl提取缓冲液蛋白污染率较EDTA-Na2低0.91%,可见KCl适合作为白菜型冬油菜叶片质外体蛋白提取缓冲液。

图1　两种提取液对质外体蛋白提取率的影响

2.2两种提取液对双向电泳IEF和SDS-PAGE的影响

由图3-4可以看出,与EDTA-Na2相比,用KCl提取的质外体蛋白盐分较少,在第1向等电聚焦IEF过程中,EDTA-Na2提取的质外体蛋白经过11.5 h才能去除样品的盐分,而KCl则需要7.0 h就已经彻底的达到除盐的目的,除盐时间明显短于EDTA-Na2。第2向SDS-PAGE过程中,KCl提取液对质外体蛋白提取更加充分,基本没有条纹状蛋白,且获得的蛋白质斑点数、清晰度、低丰度蛋白的表达量都明显优于EDTA-Na2,表现出了更好的聚焦效果,得到较好的2-DE图谱,有利于后续的分析研究。

图2　两种提取液对质外体蛋白污染率的影响

图3　不同提取液对等电聚焦的影响

2.3离心转速对质外体蛋白提取率及污染率的影响

由图5可知,离心转速在3 000～4 000 r/min时,蛋白质的提取率随着离心转速的增长而升高,4 000 r/min时蛋白质提取率达到最大,较初始离心转速(3 000 r/min)高17.9%,继续提高离心转速,蛋白提取率没有增加反而呈下降趋势。由图6可知,随着离心转速的提高,在3 500 r/min时,较初始离心转速蛋白质的污染率几乎没有变化,之后继续提高转速,蛋白污染率陡然增大,其原因可能是随着离心转速的增大,细胞膜受到破坏,导致胞内蛋白被离心出来,质外体蛋白受到污染,虽然4 000 r/min时的蛋白提取率较3 500 r/min时高,但是污染率较高。综合以上因素考虑,3 500 r/min为提取白菜型冬油菜叶片质外体蛋白的最佳离心转速。

图5　离心转速对质外体蛋白提取率的影响

图6　离心转速对质外体蛋白污染率的影响

随着离心时间的延长,蛋白提取率呈先增加后保持不变的趋势(图7),当离心时间为20 min时,蛋白提取率达到最高,质外体蛋白已基本离心彻底,而离心时间再延长,质外体蛋白提取率并不再升高。由图8可知,在离心时间为15～25 min时,随着离心时间的延长,蛋白污染率几乎没有变化,综合对蛋白质提取率和污染率的影响比较，离心时间为20 min时,质外体蛋白提取效果最优。

图7　离心时间对质外体蛋白提取率的影响

图8　离心时间对质外体蛋白污染率的影响

2.5低温胁迫下白菜型冬油菜叶片质外体差异蛋白点的表达分析

使用PDQuest 8.0软件分析2-DE图(图9),进行自动匹配,并结合肉眼观察及手动调整,共检测到339个发生了具有统计学显著差异的丰度变化蛋白点,低温胁迫前后,陇油7号叶片中蛋白点表达量变化在2倍以上的为46个,包括上调表达蛋白点18个，下调表达蛋白点21个，特异性表达蛋白点7个，从而说明油菜叶片能够通过改变原有蛋白质的含量和性质来调节体内代谢的平衡，进一步提高机体抵御寒害的能力。低温胁迫下,植株体内原有蛋白质的含量发生明显变化,以适应逆境胁迫,其双向电泳凝胶图谱与常温下不同,这意味着低温胁迫影响油菜叶片可溶性蛋白质结构与组分的变化。当植物受到低温胁迫的刺激时,就会诱导相关基因的启动表达,导致合成一些新的蛋白质(图9-B中点43～46、图10),即诱导表达蛋白点;这表明在正常条件下这些蛋白丰度较低或不表达,而在低温胁迫下才表达发挥功能,使植物体内发生一系列生理生化变化,进而使植物耐受或抵御低温环境的胁迫。与此同时,低温也会导致一些正常基因表达通路受阻,致使体内部分原有蛋白质表达受到抑制(图9-A中点2，3，28、图10),即抑制表达蛋白点。低温胁迫下,相关基因的诱导表达和抑制,是植物对不良生存环境的适应性表现,同时,对植物的耐逆性在一定程度起到了驯化的作用。

A.对照；B.低温胁迫。

图10　差异蛋白点局部放大图(质变)

2.6差异表达蛋白质的质谱鉴定及功能分类

切取低温胁迫前后抑制和诱导表达的7个蛋白点(图10中2，3，28，43～46),用胰蛋白酶进行胶内酶解,进行MALDI-TOF-TOF MS质谱分析和数据库检索(表2),最后成功鉴定5个蛋白点,蛋白点2，3可能由于蛋白质量少、数据库不完整或样品中蛋白质复杂度较高等原因未鉴定出结果。

表2　特异蛋白点MALDI-TOF-TOF MS质谱鉴定结果

3　讨论

当前,质外体蛋白研究的瓶颈仍然是如何获得高提取率和低污染率的蛋白样品;质外体蛋白提取受提取液、压强、离心力等诸多因素的影响,其提取的关键是最大程度的防止胞外蛋白受到胞内蛋白的污染且尽可能最大量地获取胞外蛋白。因此,在提取过程中选择质外体蛋白亲和力高的提取缓冲液且保证细胞膜的完整性是提取质外体蛋白的核心所在。本试验比较了2种不同提取液对白菜型冬油菜叶片质外体蛋白的提取效果,结果显示KCl提取缓冲液对质外体蛋白的提取效果明显优于EDTA-Na2提取缓冲液,不仅蛋白提取率较高,而且污染率更低,据相关文献报道[21],污染率低于1% 即可视为无明显污染。KCl对质外体蛋白的提取效率的影响原因可能是其对质外体蛋白的溶解更加充分,据Angyal报道[22]钾离子对酸性和中性的多糖具有较强的螯合能力,能够以竞争的方式与质外体蛋白结合,从而更容易被KCl提取缓冲液洗脱下来,这与本试验的结果类似。此外,在保证合适的压强下,导致质外体蛋白污染的潜在因素是离心转速过大或离心时间过长,高的离心转速或长的离心时间都会破坏细胞膜的柔韧性,使其破裂。相反,则会显著降低质外体蛋白提取率。由于白菜型冬油菜叶片中含有大量的酚类、醌类、多糖类、脂类和色素等植物次级代谢产物,所以选择不同的提取液能够导致最后蛋白点的差异。舒佳宾等[23]研究表明,样品中的盐分、水溶性有机物、大分子带电基团等都会对聚焦过程造成影响。本试验中,以KCl为缓冲液提取的质外体蛋白盐分更少,蛋白纯度更高,能够更好地满足双向电泳所需的条件,为后续利用双向电泳技术分析质外体蛋白质组学研究奠定了良好的基础。

前人研究发现,低温胁迫下植物细胞会发生一系列生理生化反应来抵御冷害,如抗氧化酶系统活性的升高,可溶性蛋白、游离脯氨酸、可溶性糖等渗透调节物质的积累,有机物质的再分配,细胞膜脂氧化反应的转化及蛋白质表达变化等。本试验发现,低温胁迫后,陇油7号叶片蛋白质组发生了明显变化。核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(蛋白点28)是植物光合作用过程中的关键酶,其活性与光合作用密切相关[24],本试验发现该蛋白点在低温胁迫后被抑制表达,说明低温胁迫下,陇油7号叶片光合机构受损,进行光合作用的质子传递链受到破坏或中断,导致光合磷酸化过程被抑制;果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(蛋白点43)是糖酵解和糖异生过程中的一个关键酶,该酶主要参与可溶性糖的合成及响应低温胁迫诱导表达,可溶性糖作为渗透调节物质,一方面可以防止胶状细胞质冷凝,避免形成的冰晶对细胞造成机械损伤;另一方面可以维持细胞内外渗透压,提高组织含水量,降低细胞质的冰点,从而提高了陇油7号对低温的耐受性;汤晓丽[25]在拟南芥的研究中通过表型分析及基因芯片检测发现,在低温致死的突变体中,果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因的表达量都发生明显的上调,孙得壬[26]研究发现，在一定阈值的低温胁迫下，都会诱导不同小麦品种果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因的积极响应，表现出表达量的显著上调，从而使得相应的蛋白质合成并不断积累,这与本结果相同。巯基蛋白酶抑制剂(蛋白点44)具有保护细胞、组织及器官中蛋白质免遭外源蛋白水解酶水解的作用[27];此外,试验结果表明蛋白水解酶抑制剂基因的超表达也能提高转基因植物抗低温、干旱等非生物胁迫能力。沙冬青作为我国西北重要的抗逆植物资源,Liu等[28]克隆到了沙冬青低温诱导AmpI基因,经鉴定属于巯基蛋白酶抑制剂基因。类甜蛋白(蛋白点45)是一种具有多种生物学活性及重要功能的植物防御蛋白,植物受到生物或非生物胁迫时,类甜蛋白在植物组织中迅速表达并积累,从而快速提高植物抗性[29]。杨成丽等[30]研究发现,冬黑麦叶片质外体在低温诱导下分泌的类甜蛋白,其抗冻活性与抗冻蛋白相同。抗病毒蛋白(蛋白点46),一方面能够诱导植物病程相关蛋白的表达,此蛋白在低温胁迫下不断积累进而诱导植株获得抗寒性[31];另一方面能够诱导其他蛋白或物质的产生,使植株产生系统抗性,从而抵御外界胁迫对植株造成的伤害[32-33]。在低温下陇油7号抗寒响应相关蛋白的表达与积累,可有效地防止低温对细胞生理、结构的损伤,从而明显地提高其抗寒能力。

在质外体溶液受原生质污染程度小于1%且尽量提取完全,双向凝胶电泳图谱清晰,蛋白点完全分离的前提下,白菜型冬油菜叶片质外体蛋白提取的最佳方法是以KCl为提取缓冲液,真空度35 kPa、真空渗透时间15 min、离心转速3 500 r/min、离心时间20 min。同时,低温胁迫下,相关蛋白组成的强大抗逆防御机制对维持陇油7号的生长发育具有重要的作用。

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Extraction of Winter Turnip Rape Leaf Apoplast and Analysis of Protein Expression in Response to Low Temperature Stress

YUAN Jinhai2,LIU Zigang1,2,SUN Wancang1,2,ZENG Xiucun1,3,MA Li2,FANG Yuan2,LIU Haiqing2,GUO Rendi2,WANG Zhijiang2,CHEN Qi2,WANG Kaiyin2,LIU Linbo2

(1.Gansu Engineering and Technology Research Center of Rapeseed,Lanzhou730070,China;2.Agronomy College,Gansu Agricultural University,Gansu Key Laboratory of Crop Improvement &Germplasm Enhancement,Gansu Provincial Key Laboratory of Aridland Crop Science,Lanzhou730070,China;3.College of Agronomy and Biotechnology,Hexi University,Zhangye734000,China)

In order to explore the mechanism of super cold resistant varieties of Winter turnip rape,select super cold resistant varieties of Winter turnip rape Longyou No.7 leaves as materials,using two different extraction liquids(Extraction A:0.1 mol/L Tris-HCl (pH=7.6),0.2 mol/L KCl,1 mmol/L PMSF,Extraction B:0.05 mol/L Tris-HCl (pH=7.6),0.01 mol/L EDTA-Na2,0.02 mol/L Vc,1 mmol/L PMSF) to compare the extracted effect.The experiment showed that the extraction A liquid protein yield reached (0.073±0.004 6) mg/g,and the extraction ratio increased by 42.88% compared to liquid B.Through the Glucose-6-phosphate dehydrogenize (G6PDH) activity detection and the extraction A was lower than B 0.91 percent;not only the extraction A extract protein was shorter than B 4.5 hours in the first oelectric focusing electrophoresis of two-dimensional electrophoresis,but also was get clear gel map;through the calculation of abundance,there were total 339 differentially expressed proteins discovered in Longyou No.7 under low temperature stress(4 ℃,48 h)later,changes in expression levels of more than two times the protein spots of 46,which 18 up-regulated protein expression spots,21 down-regulated protein expression spots,7 specific protein expression spots,these differential protein spots were suggested to be related to low temperature stress.This laid the foundation for the research of cold resistant varieties in Winter turnip rape Longyou No.7 proteomics aspect.

Apoplast;Longyou No.7;Protein;Two-dimensional electrophoresis

2016-03-12

国家“863”高技术研究发展计划项目(2011AA10A104);国家自然科学基金项目(31460356);国家“973”计划项目(2015CB150206);国家农业科技成果转化项目(2014G10000317);国家自然基金项目(31560397);甘肃省自然基金项目(145RJZG050)

袁金海(1988-),男,甘肃靖远人,在读硕士,主要从事油菜遗传育种研究。

刘自刚(1975-),男,甘肃天水人,副教授,博士,主要从事油菜遗传育种研究。

Q945.78;Q946

A

1000-7091(2016)04-0044-07

10.7668/hbnxb.2016.04.008