刘　静,乔麟轶,,张晓军,李　欣,詹海仙,郭慧娟,张小辉,冯建宁,畅志坚,

(1.山西大学 研究生院,山西 太原　030006;2.山西省农业科学院 作物科学研究所,作物遗传与分子改良山西省重点实验室,山西 太原　030031;3.山西农业大学 研究生院,山西 太谷　030801)



小麦抗白粉病基因Pm43定位区段内RGA分析

刘静1,乔麟轶1,2,张晓军2,李欣2,詹海仙2,郭慧娟2,张小辉1,冯建宁3,畅志坚1,2

(1.山西大学 研究生院,山西 太原030006;2.山西省农业科学院 作物科学研究所,作物遗传与分子改良山西省重点实验室,山西 太原030031;3.山西农业大学 研究生院,山西 太谷030801)

利用普通小麦测序草图可从基因组范围内对小麦单条染色体上的某个区段进行分析。Pm43是作物遗传与分子改良山西省重点实验室在小麦2D染色体长臂上定位的一个抗白粉病基因。利用信息学方法分析Pm43所在物理图谱、遗传图谱和基因组图谱上的位置,可为其精细定位乃至候选基因的确定提供参考。试验采用Pm43两侧标记序列进行比对,将Pm43定位于染色体C-2DL3-0.49区间的79～99 cM内,所在基因组区段为2DL_9835990～2DL_9823315。利用目前已克隆小麦抗病基因的保守基序作为探针,从目标区段内检索出89条包含抗病基因类似物(Resistance gene analogues,RGA)序列的scaffold,其中,36条scaffold被诊断出含有SSR位点,之后针对SSR位点开发分子标记。利用携带有Pm43的普通小麦材料CH5025、感白粉病材料台长29以及CH5025×台长29 的F2作图群体的抗感池DNA,对开发的SSR标记进行连锁性检测,共筛选出4个多态性标记,从而将目标区段进一步确定在标记PK_9908430和NBS_9908778之间。最后经聚类分析,筛选出与已克隆Pm基因同源性较高的1个PK序列和1个NBS序列,且在粗山羊草2D染色体和水稻第4染色体中均存在与这2个序列同源的RGA表达序列。

Pm43;小麦基因组;2D染色体;PK;NBS

随着小麦种植密度的加大和水肥条件的改善,小麦白粉病已成为我国各大麦区普遍发生的主要病害。据统计,2015年全国小麦白粉病发病面积约为570万hm2,造成小麦产量的严重损失[1]。而研发抗白粉病基因、选育抗病品种是减少其病害损失最为经济有效的方法[2]。

目前国际上正式命名的54个抗白粉病基因中,有5个基因已经被克隆,其分别是来源于簇毛麦的Pm21[3]和普通小麦的Pm3b[4]、Pm3c[5]、Pm3f[6]、Pm3g[5]。其中,Pm21编码蛋白激酶(Protein kinase,PK),Pm3b-g编码一个核苷酸结合位点(Nucleotide binding site,NBS)结构域。PK和NBS是广泛存在于植物界的2种保守抗病结构,在植株抵御病原菌侵染过程中起着关键作用[7]。

Pm43是作物遗传与分子改良山西省重点实验室于2009年在小麦2D染色体长臂上定位的一个抗白粉病基因[8-9],距其两侧分子标记Xwmc41和Xbarc11的遗传距离分别为2.3,4.2 cM。2014年普通小麦测序草图[10]的公布,使得从基因组范围内分析单条染色体上的某个区段成为可能。本试验利用小麦基因组测序数据,对Pm43初定位区段内具有完整序列的抗病基因类似物(Resistance gene analogues,RGA)进行分析,以期为候选基因的确定提供参考依据。

1　材料和方法

1.1试验材料

普通小麦抗白粉病材料CH5025(携带Pm43)和感白粉病材料台长29的DNA模板以及CH5025×台长29 F2作图群体的抗感池均由作物遗传与分子改良山西省重点实验室提供。

1.2试验方法

1.2.1目标区段分析从URGI数据库中下载小麦2DL染色体序列数据建立本地数据库。利用Pm43的连锁标记序列检索本地库,同时在GrainGene数据库中比对小麦2D染色体遗传图谱[11]和物理图谱,以获得Pm43在2DL染色体的区段位置信息。

1.2.2区段内RGA序列的分离和检测从本地库中分离出目标区段序列数据,利用PK家族(Pfam登录号:PF00069)和NBS家族(PF00931)的隐马模型文件,分别检索区段数据获得氨基酸序列,设E≤1e-5。利用SMART服务器对检索结果进行保守结构域的检查,参数为默认值。

1.2.3RGA-SSR位点诊断、引物开发和PCR检测利用SSRhurnter软件查找RGA所在scaffold序列的SSR位点。利用Primer5软件在SSR位点两侧设计引物(由生工公司合成)(表1)。

表1　与Pm43连锁的4对RGA-SSR标记

PCR总体系为15 μL:含1.5 μL 10× Buffer (TaKaRa),0.2 mmol/L dNTP(0.3 μL),1 U(0.15 μL)Taq酶(TaKaRa)、0.25 μmol/L(2 μL)引物和100 ng模板DNA(1.5 μL)、H2O(9.55 μL)。反应扩增程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s,58 ℃复性45 s,72 ℃延伸 1 min,共36个循环;72 ℃延伸10 min。对扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr与Bis质量比为29∶1)电泳,经硝酸银染色后观察照相。

1.2.4序列聚类分析和共线性分析用ClustalX软件进行蛋白序列多重比对,采用邻接法(Neighbor-joining)构建系统发生树,用MEGA软件输出图形,设Bootstrap值为1 000。利用RGA序列分别检索粗山羊草GIGA数据库和水稻RGAP数据库,以获得共线性RGA序列相关信息。

2　结果与分析

2.1Pm43所在区段确定

区段分析结果表明,Pm43(图1-A)位于2D染色体物理图谱的C-2DL3-0.49区间(图1-B)及遗传图谱[11]的79～99 cM内(图1-C)。Pm43两侧最近的分子标记Xwmc41和Xbarc11[9]分别位于2DL基因组[10]序列2DL_9835990和2DL_9823315上,由此确定了Pm43所在基因组区段(图1-D)。

图1　Pm43(A)所在2DL物理图谱(B)、遗传图谱(C)和基因组图谱(D)的区段分析

2.2区段内RGA-SSR标记开发与连锁性检测

通过信息学检索,从Pm43所在基因组区段共获得89条包含RGA的基因组序列(scaffold),其中,64条含PK序列,25条含NBS序列。SSR诊断结果表明,上述RGA-scaffold中有36条含有简单重复序列位点,从中随机取1/2序列,根据序列上SSR位点设计引物,共开发出18对RGA-SSR标记,以“RGA名称+scaffold编号”暂时命名,这些标记线性排列于Pm43基因组区段内(图2-A)。

经过连锁性检测,PK_9908430、NBS_9862754、NBS_9906982和NBS_9908778在抗感亲本间和抗感池间均表现出多态性(图2-B、图3),初步推断,这4对RGA-SSR标记可能与Pm43连锁。

*.序列能在植株中表达;Pr.抗病亲本CH5025;Ps.感病亲本台长29;Br.抗病池;Bs.感病池。

M.500 bp DNA ladder;Pr.抗病亲本CH5025;Ps.感病亲本台长 29;Br.抗病池;Bs.感病池。

2.3小区段内RGA聚类和共线性分析

进一步检索发现,在多态性标记PK_9908430和NBS_9908778之间的基因组范围内共存在22个PK序列和7个NBS序列。聚类分析结果表明,PK序列中Ta2dlLoc010614与已克隆的Pm21相似性最高(图4-A),NBS序列中Ta2dlLoc017419与Pm3b、Pm3c、Pm3f、Pm3g的相似性最高(图4-B)。

由这2个RGA序列检索粗山羊草和水稻数据库可知,PK序列Ta2dlLoc010614与粗山羊草2D染色体上的PK序列AEGTA01197、水稻第4染色体上的PK序列Os04g39180同源,NBS序列Ta2dlLoc017419也分别在粗山羊草2D和水稻第4染色体上找到了同源序列(图2-D、E),表明Pm43区段序列与粗山羊草2D染色体和水稻第4染色体对应区段具有较好的共线性。更重要的是,对应的AetRGA和OsRGA均为在植株中表达的序列,由此推断Ta2dlLoc010614和Ta2dlLoc017419很可能也在小麦抗病生理过程中发挥作用。

图4　Pm43小区段内PK序列(A)和NBS序列(B)的聚类分析

3　结论与讨论

3.1利用小麦基因组数据分析Pm43所在区段的可行性

普通小麦基因组草图的完成,对于抗病基因的精细定位乃至克隆有着巨大的推动作用。Pm43是源于八倍体小偃麦的一个抗病基因,与其他近缘属相比,偃麦草染色体(尤其是J/Js染色体)与小麦染色体存在很高的同源性[12-13],容易发生交换,且交换后的染色体在其结构上更接近于小麦。因此,最初与小麦发生交换的外源片段本身与小麦基因组存在一定程度的相似性,加之与普通小麦品种历经10余年的杂交、回交过程,目前在携带Pm43的材料中用基因组原位杂交(GISH)技术已经检测不到任何外源信号,表明Pm43及其两侧现存的外源序列已经与小麦基因组高度相似。此外,RGA相关结构在植物界中十分保守,因此,对Pm43所在小麦基因组区段内具有抗病结构的序列进行分析具有可行性。

3.2目标区段内RGA分析

PK和NBS是植物界中最重要的两类抗病结构,典型的PK类抗病基因有大麦Rpg1[14]、番茄Pti1[15]、水稻Xa3/21/26[16]等,而NBS类抗病基因更是数量庞大,仅在小麦中目前已经克隆了Pm3b[4]、Pm3c[5]、Pm3f[6]、Pm3g[5]、Yr10[17]、Lr1[18]、Lr10[19]、Lr21[20]、Sr33[21]、Sr35[22]、Cre1和Cre3[23]12个抗病基因,此外,Lr24[24]和Lr35[25]也被证实可能为NBS类基因。本试验利用信息学方法对Pm43所在基因组区段内包含PK或NBS结构的scaffold进行检索,随后开发RGA-SSR标记进行连锁性检测,将目标区段进一步确定在标记PK_9908430和NBS_9908778之间,从中选出了与已克隆Pm基因同源性较高的1个PK序列和1个NBS序列,这2个序列均能在粗山羊草和水稻基因组中找到可表达的同源RGA序列,因此,今后有必要对这些序列的功能进行深入研究,为Pm43候选基因的确定提供参考依据。

[1]全国农业技术推广服务中心.2015年全国小麦重大病虫害发生趋势预报[EB/OL].[2015-01-20].http://cb.natesc.gov.cn/sites/cb/List_28092_151760.html.

[2]Line R F,Chen X M.Success in breeding for and managing durable resistance to wheat rusts[J].Plant Disease,1995,79(12):1254-1255.

[3]Cao A,Xing L,Wang X,et al.Serine/threonine kinase geneStpk-V,a key member of powdery mildew resistance genePm21,confers powdery mildew resistance in wheat[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2011,108(19):7727-7732.

[4]Yahiaoui N,Srichumpa P,Dudler R,et al.Genome analysis at different ploidy levels allows cloning of the powdery mildew resistance genePm3bfrom hexaploid wheat[J].The Plant Journal:for Cell and Molecular Biology,2004,37(4):528-538.

[5]Tommasini L,Yahiaoui N,Srichumpa P,et al.Development of functional markers specific for seven Pm3 resistance alleles and their validation in the bread wheat gene pool[J].Theoretical and Applied Genetics,2006,114(1):165-175.

[6]Srichumpa P,Brunner S,Keller B,et al.Allelic series of four powdery mildew resistance genes at the Pm3 locus in hexaploid bread wheat[J].Plant Physiology,2005,139(2):885-895.

[7]Meyers B C,Kozik A,Griego A,et al.Genome-wide analysis of NBS-LRR-encoding genes inArabidopsis[J].The Plant Cell,2003,15(4):809-834.

[8]刘建霞,贺润丽,畅志坚,等.源于中间偃麦草的小麦新品系CH5026白粉病抗性的遗传[J].华北农学报,2008,23(1):194-198.

[9]He R,Chang Z,Yang Z,et al.Inheritance and mapping of powdery mildew resistance genePm43 introgressed fromThinopyrumintermediuminto wheat[J].Theoretical and Applied Genetics,2009,118(6):1173-1180.

[10]International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC).A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat(Triticumaestivum)genome[J].Science,2014,345:1251-1288.

[11]Somers D J,Isaac P,Edwards K.A high-density microsatellite consensus map for bread wheat (TriticumaestivumL.)[J].Theoretical and Applied Genetics,2004,109(6):1105-1114.

[12]Chen Q,Conner R L,Laroche A,et al.Molecular cytogenetic evidence for a high level of chromosome pairing among different genomes inTriticumaestivum-Thinopyrumintermediumhybrids[J].Theoretical and Applied Genetics,2001,102(6/7):847-852.

[13]闫金龙,畅志坚,孙美荣,等.中间偃麦草抗小麦白粉病基因导入及其抗性评价[J].华北农学报,2010,25(3):225-230.

[14]Brueggeman R,Rostoks N,Kudrna D,et al.The barley stem rust-resistance geneRpg1 is a novel disease-resistance gene with homology to receptor kinases[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2002,99(14):9328-9333.

[15]Zhou J,Loh Y T,Bressan R A,et al.The tomato genePti1 encodes a serine/threonine kinase that is phosphorylated by Pto and is involved in the hypersensitive response[J].Cell,1995,83(6):925-935.

[16]Sun X,Cao Y,Wang S.Point mutations with positive selection were a major force during the evolution of a receptor-kinase resistance gene family of rice[J].Plant Physiology,2006,140(3):998-1008.

[17]Liu W,Frick M,Huel R,et al.The stripe rust resistance geneYr10 encodes an evolutionary-conserved and unique CC-NBS-LRR sequence in wheat[J].Molecular Plant,2014,7(12):1740-1755.

[18]Cloutier S,Mccallum B D,Loutre C,et al.Leaf rust resistance geneLr1,isolated from bread wheat (TriticumaestivumL.) is a member of the large psr567 gene family[J].Plant Molecular Biology,2007,65(1/2):93-106.

[19]Sela H,Spiridon L N,Petrescu A J,et al.Ancient diversity of splicing motifs and protein surfaces in the wild emmer wheat (Triticumdicoccoides) LR10 coiled coil (CC) and leucine-rich repeat (LRR) domains[J].Molecular Plant Pathology,2012,13(3):276-287.

[20]Huang L,Brooks S A,Li W,et al.Map-based cloning of leaf rust resistance geneLr21 from the large and polyploid genome of bread wheat[J].Genetics,2003,164(2):655-664.

[21]Periyannan S,Moore J,Ayliffe M,et al.The geneSr33,an ortholog of barleyMlagenes,encodes resistance to wheat stem rust race Ug99[J].Science,2013,341(6147):786-788.

[22]Saintenac C,Zhang W,Salcedo A,et al.Identification of wheat geneSr35 that confers resistance to Ug99 stem rust race group[J].Science,2013,341(6147):783-786.

[23]De Majnik J,Ogbonnaya F C,Moullet O,et al.The cre1 and cre3 nematode resistance genes are located at homeologous loci in the wheat genome[J].Molecular Plant-microbe Interactions,2003,16(12):1129-1134.

[24]张立荣,杨文香,刘大群.小麦NBS类抗病基因类似序列的多样性和进化关系研究[J].华北农学报,2011,26(4):23-26.

[25]高倩,王海燕,刘大群,等.小麦抗叶锈病基因Lr35的RGA分析[J].华北农学报,2008,23(6):50-53.

Analysis of Resistance Gene Analogues from the Section of Mildew Powdery Resistance GenePm43 in Wheat

LIU Jing1,QIAO Linyi1,2,ZHANG Xiaojun2,LI Xin2,ZHAN Haixian2,GUO Huijuan2,ZHANG Xiaohui1,FENG Jianning3,CHANG Zhijian1,2

(1.Graduate School of Shanxi University,Taiyuan030006,China;2.Institute of Crop Sciences,Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Shanxi Key Laboratory of Crop Genetics and Molecular Improvement,Taiyuan030031,China;3.Graduate School of Shanxi Agricultural University,Taigu030801,China)

Draft sequencing data of common wheat can be used to analysis a target section of single chromosome from genome-wide in wheat.A powdery mildew resistance gene,Pm43,was assigned on the long arm of wheat 2D chromosome by Shanxi Key Laboratory of Crop Genetics and Molecular Improvement.Bioinformatics methods were used to determine the position ofPm43 in the physical map,genetic map and genome map in wheat.The results provided a reference to the fine mapping or the candidate genes determining ofPm43.By aligning the sequences of flanking markers,thePm43 was mapped on the 79-99 cM of C-2DL3-0.49 section,which was between 2DL_9835990 and 2DL_9823315 in genomic region.Using the conserved motifs of cloned resistance genes in wheat as a probe,89 RGA (Resistance gene analogues)-scaffolds were retrieved from the target region,and 36 scaffolds were containing SSR loci.Then SSR markers were developed.Applying the resistant (R) parent CH5025 carriedPm43,the susceptible (S) parent Taichang 29 and two R/S bulks of F2population crossed by CH5025 and Taichang 29,the linkage of developed SSR markers andPm43 was detected.Four polymorphic markers were screened and further defined the target region between PK_9908430 and NBS_9908778.Then by cluster analysis,one PK sequence and one NBS sequence which had the highest homology with clonedPmwere screened,and their homologous RGA expressed sequences were found fromAegilopstauschiiand rice genome.

Pm43;Wheat genome;Chromosome 2D;PK;NBS

2016-01-08

国家自然科学基金项目(31171839);山西省青年基金项目(2015021145);山西省科技攻关项目(20150311001-5);山西省国际合作项目(201603D421003);山西省农科院攻关项目(15YGG01)

刘静(1991-),女,山西柳林人,在读硕士,主要从事小麦抗病基因研究。

畅志坚(1959-),男,山西万荣人,研究员,硕士生导师,主要从事小麦抗病育种与种质创新研究。

S435.121.4+6;Q78

A

1000-7091(2016)04-0026-05

10.7668/hbnxb.2016.04.005