董　婧,逯晓萍 ,吕二锁,薛春雷，李俊伟

(1.内蒙古农业大学 农学院,内蒙古 呼和浩特　010019;2.内蒙古农牧业科学院,内蒙古 呼和浩特　010031)



玉米蛋白质组研究中双向电泳技术条件的优化

董婧1,逯晓萍1,吕二锁2,薛春雷1，李俊伟1

(1.内蒙古农业大学 农学院,内蒙古 呼和浩特010019;2.内蒙古农牧业科学院,内蒙古 呼和浩特010031)

为了优化玉米叶片双向凝胶电泳技术条件,通过比较3种总蛋白提取方法对玉米双向电泳结果的影响,并对蛋白质上样量、IEF等电聚焦条件及SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓度等参数进行探索、优化;结果发现,与酚提取法和磷酸缓冲液法相比,采用改进的TCA/丙酮法提取总蛋白操作简单、方便,所得的2-DE图谱中蛋白质点数量多、背景清晰,是一种适用于提取玉米苗期叶片总蛋白的有效方法;同时筛选出:第一向IEF等电聚焦样品上样量为800 μg,聚焦条件为20 000 V/h,在浓度为12.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,能够在17 cm的IPG胶条上获得背景低、分辨率较高、重复性好的双向电泳图谱,该优化体系适用于玉米叶片蛋白质组双向电泳分离,对玉米蛋白质组学研究具有重要参考价值。

玉米;叶片;蛋白质提取;双向电泳

在生命科学中,对蛋白质组学的研究已成为功能基因组研究的重要手段与内容。利用蛋白质组学研究方法改良农作物的遗传性状,指导抗逆及抗病育种等研究都具有重要意义[1-2]。最早由Wilkins在1994年首次提出[3]蛋白质组概念,指总体分析细胞内不断变化的蛋白质组成成分、表达水平及性质,进一步了解蛋白质之间的相互作用与联系,是揭示蛋白质的结构、性质、功能以及细胞生命活动规律的一个研究领域。随着生命科学的发展,蛋白质组学已成为生命科学研究的重心[4-5];蛋白质组学是功能基因组学的研究内容之一,而双向电泳分离技术则是最为经典的蛋白质分离技术。玉米作为我国重要的粮食和能源作物,对它的蛋白质组学研究也正在进行中,涉及遗传、生理生化和生态等诸多生物学领域,其中包括组织器官的分化过程、亚细胞器新蛋白的发现和功能的鉴定,以及玉米对干旱、缺氧等非生物胁迫和真菌、细菌等生物胁迫的适应机制及各种突变体研究领域等[6-8]。随着蛋白质组学理论与技术的不断发展与创新,在玉米遗传、发育、育种研究中的应用也将会越来越被重视[9]。

蛋白质提取质量的好坏是决定双向电泳试验成功与否的关键因素。因此,应根据不同作物、不同研究目的选择适合的蛋白质提取方法,以期获得满意的双向电泳图谱[10]。通常植物组织中含有较多的干扰蛋白质提取、分离和鉴定的蛋白水解酶以及多酚、色素、醌类及碳水化合物等干扰物质,这些物质的存在干扰了蛋白质双向电泳分离效果。本试验以合饲一号玉米品种的苗期叶片为试材,比较分析不同蛋白质提取方法对玉米苗期叶片总蛋白的提取效果,同时在IEF电泳条件、蛋白质上样量以及 SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓度等的选择上进行优化,探索适合于玉米苗期叶片蛋白质组学研究的双向电泳技术,为开展玉米蛋白质组学研究提供技术支持。

1　材料和方法

1.1试验材料

供试材料为玉米合饲一号[蒙审玉(饲)2012001],选取成熟饱满的种子种植于实验室恒温培养箱内,幼苗培养至三叶期进行总蛋白的提取,或将幼苗叶片用液氮速冻,于-80 ℃冰箱储存、备用。

1.2幼苗叶片总蛋白的提取方法

1.2.1三氯乙酸/丙酮提取法将供试玉米幼苗培养至三叶期,取三叶期新鲜叶片用蒸馏水清洗、擦干,液氮速冻后于-80 ℃保存、备用;称取速冻叶片约 0.3 g,加少量聚乙烯吡咯烷酮约0.03 g,于冷冻条件下研磨至粉末状;吸取已预冷的蛋白质提取液Ⅰ(含0.07%β-巯基乙醇的10%三氯乙酸丙酮溶液) 4.5 mL加入玉米叶片粉末中,再将混合液转入空的 5 mL 离心管中,-20 ℃冰箱中放置1 h左右,期间摇晃2～3次;在 4 ℃条件下,12 000 r/min 离心40 min,弃上清液。加入 4.5 mL预冷的蛋白质提取液Ⅱ(含0.07%β-巯基乙醇丙酮)进行悬浮、振荡,-20 ℃冰箱放置 1 h 以上,离心弃上清液,此步骤重复 2 次。再加入 4.5 mL 预冷的 80% 丙酮进行悬浮、离心、弃上清液,于通风橱干燥15 min左右。干燥后,称取蛋白质干粉质量,进行蛋白质溶解。

1.2.2酚提取法该方法根据付忠军等[11]的植物总蛋白提取方法略作改进。称取2 g新鲜的玉米幼苗叶片,在液氮中快速研磨成精细粉末,分别加入 0.8 mL苯酚(Tris缓冲液pH值8.0,Sigma) 和0.8 mL SDS 缓冲液(30%蔗糖,2% SDS,65 mmol/L DTT,0.1 mol/L Tris-HCl,pH值8.0),振荡、混匀后将混合液转移到2 mL离心管中,于磁力搅拌器上涡旋30 s,之后在4 ℃下12 000 r/min离心5 min,将上层约400 μL的苯酚相转到新的 2 mL离心管中;同时,在苯酚相中加入 5倍体积的含0.1 mol/L 乙酸铵的甲醇溶液,-20 ℃冰箱中放置约50 min;之后在4 ℃条件下以12 000 r/min离心10 min,离心结束后用预冷的甲醇乙酸铵溶液冲洗2次,最后用80%丙酮悬浮、离心2 次,弃上清液,收集沉淀于通风橱干燥。干燥后,称取蛋白质干粉质量,进行蛋白质溶解。

1.2.3磷酸缓冲液提取法吸取蛋白质磷酸缓冲液提取液(1 mol/L KH2PO4+K2HPO4,使用前加1 mol/L L-苯甲基磺酰氟)3.5 mL加入5 mL离心管中,置于冰上预冷;剪取玉米幼苗三叶期新鲜叶片,用纯净水清洗、滤纸擦干,去主脉剪成约1 cm 小段,称取2 g叶片,在液氮冷冻条件下迅速研磨成精细粉末;然后转入离心管中混匀,冰上静置3～4 h,4 ℃条件下离心,12 000 r/min,45 min。将上清液转到新的离心管再离心1次,取上清即蛋白提取液,于-80 ℃保存备用。

1.3蛋白质的溶解

采用称量法计算蛋白干粉质量,每mg蛋白质干粉加 20～30 μL裂解液,成分为(5% β-巯基乙醇、9.0 mol/L 尿素、4%两性电解质、0.2% pH值 3～10 两性电解质载体),充分混合,悬浮、振荡2 min,35 ℃保温 30 min,12 000 r/min离心 40 min,取上清液即为蛋白提取液,-80 ℃保存备用。

1.4IEF等电聚焦电泳条件的优化

在第一向IEF等电聚焦时选用 IPG 固相胶条(pH值4～7,长17 cm)及 IPG phorⅡ系统,取蛋白样品加裂解液至总体积为450 μL,缓慢均匀加入到IPG胶条槽内,使IPG固相胶条胶面朝下覆于样品上,最后加2～3 mL矿物油于胶面上,操作完成后将聚焦槽放置于Ettan DALT six型电泳仪内,每根胶条以50 μA的极限电流和18～20 ℃聚焦温度,设计了4个IEF等电聚焦条件进行优化。

IEF等电聚焦运行程序Ⅰ设置为:18 ℃,50 V主动水化16 h,250 V线性除盐 30 min,500 V快速除盐30 min,4 000 V线性升压3 h,20 000 V/h 快速聚焦和500 V 72 h保持;程序Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的聚焦参数分别为14 000,17 000,23 000 V/h聚焦,其余条件相同 (表1)。

表1　IEF等电聚焦参数

等电聚焦结束后,将胶条依次放入平衡液Ⅰ(6 mol/L Urea,20.0%甘油,2.0%DTT,2.0%SDS,0.375 mol/L This-HCl pH值8.8)和平衡液Ⅱ(6 mol/L Urea,20.0%甘油,2.5 %碘乙酰胺,2.0%SDS,0.375 mol/L This-HCl pH值8.8)各平衡15 min,最后转到12.5% SDS-PAGE凝胶(厚度1 mm)中进行电泳。

1.5SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓度的优化及考马斯亮蓝G-250的凝胶染色

设计10.0%,12.5%,15.0% 3个不同凝胶浓度进行总蛋白的第二向电泳优化筛选。首先将平衡好的胶条转移至12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上,一端加SDS标准蛋白质分子量标准,再用1.0%低熔点琼脂糖凝胶封闭,放入凝胶电泳系统进行电泳,设置18 ℃循环水冷却降温,80 V的电压预电泳20 min,之后换用120 V的电压电泳,当溴酚蓝指示剂距胶底边缘 1.5 cm 左右停止电泳。

采用考马斯亮蓝染色法进行凝胶染色。当电泳结束后,将胶板置于固定液(40% (V/V)甲醇,10% (V/V)冰乙酸)中固定30 min;固定结束后用超纯水漂洗15 min,重复2次;之后胶体于考马斯亮蓝染色液(0.20% (m/V) G-250考马斯亮蓝,40% (V/V)无水乙醇,10% (V/V)冰乙酸)中缓慢摇动染色4～6 h。染色接受后,将胶板转移至脱色液中脱色,待胶板背景无色为止。

1.6电泳图像扫描与分析

使用扫描仪UMAX Powerlook 2100XL将待检测的凝胶进行成像系统扫描获取图像,光学分辨率为600 dpi的透射扫描,对比度与亮度均采用软件默认值。扫描后图像用PDQuest 8.0分析软件进行斑点检测、匹配和获取斑点位置等。

2　结果与分析

2.1不同提取方法对双向电泳图谱效果的影响

样品的制备是进行双向电泳的先决条件,通常植物总蛋白的制备分为:样品提取、裂解液配方选择和杂质去除等几个关键步骤。本试验采用酚提取法、三氯乙酸/丙酮法以及磷酸缓冲液提取法制备玉米叶片总蛋白样品。采用相同的参数与方法对3种不同方法提取的玉米叶片总蛋白样品进行双向电泳的分离和检测,具体参数为:蛋白质上样量800 μg,长17 cm、pH 值4～7 IPG干胶条,12.5% SDS-PAGE 进行双向电泳分离;电泳后胶体经考染的图像结果(图1)显示,采用三氯乙酸/丙酮法(TCA)所获得的2-D图谱中蛋白点分布均一,蛋白点呈规则、清晰的圆形,图谱背景干净,横竖条纹干扰较少(图1-A)。选用酚提取法制备的蛋白质所得的2-D图谱(图1-B) 分辨率低,蛋白点较模糊,图片中显示有蛋白点拖尾现象,出现横竖纹干扰,可能是由于样品中含有较高浓度的盐离子等杂质,等电聚焦时电流比较大受到干扰。而选用磷酸缓冲液提取法制备玉米叶片总蛋白样品得到的 2-D图谱效果有明显改善(图1-C),但在图谱中检测到的蛋白点较少,蛋白质种类少,纯度不高。所以三氯乙酸/丙酮法(TCA) 电泳结果质量最佳,提取玉米总蛋白质量较好,适于玉米蛋白质组学的2-D试验。

A.三氯乙酸/丙酮法;B.酚提取法;C.磷酸缓冲液(PB)提取法。

2.2不同聚焦条件对双向电泳图谱效果的影响

IEF等电聚焦电泳是进行双向电泳技术的关键技术,聚焦能否达到平衡、是否反应完全都会影响蛋白点的分离效果[12]。在总蛋白样品的提取过程中,通过增加冷丙酮洗涤次数可有效去除玉米蛋白样品中的盐离子;同时,在等电聚集电泳中增加低电压除盐过程,使等电聚焦能达到预设的聚焦平衡电压20 000 V/h,第一向IEF等电聚焦在其他条件不变的情况下电压设置决定聚焦的效果好坏。将蛋白样品制备方法、上样量、平衡时间、SDS-PAGE凝胶浓度以及染色方法都保持一致情况下,分析比较4种不同等电聚焦条件(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)下的双向电泳效果。图2所示,当选择等电聚焦条件为20 000 V/h时,所获得的双向电泳图谱上蛋白点数量多、清晰,且蛋白点多为圆形,减少了蛋白质点的水平和垂直拖尾现象,聚焦效果也最好;聚焦时间的减少或延长,都会引起凝胶图片出现条纹或横向拖尾现象。

图2　不同聚焦条件双向电泳对比

2.3丙烯酰胺浓度对蛋白点分辨率的影响

在进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时,其分离胶浓度的大小会直接影响蛋白质分离效果的好坏,本试验设计10.0%，12.5%，15.0% 3个不同浓度的分离胶进行玉米幼苗叶片蛋白质的分离(图3)。当丙烯酰胺浓度选用12.5%,制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶时,供试样品中能够分离出多个清晰、明亮的条带,且无拖尾和弥散现象,各个条带之间的迁移率相差明显;当丙烯酰胺浓度为10.0%和15.0%制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶时,其图谱上分离出的条带较少、模糊,不够清晰,且迁移率相差较小不明显,不能对供试样品进行有效分离;此外,当凝胶浓度较大时,其凝胶胶体较脆,在第二向电泳制备大面积凝胶时容易破碎,不利于操作;其次,凝胶浓度太大,电泳时蛋白质的前沿离溴酚蓝指示剂前沿会产生较大的距离,整个电泳过程缓慢。因此,第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶的最适浓度应为12.5%,该浓度下玉米幼苗叶片总蛋白可得到有效分离。

图3　不同浓度SDS-聚丙烯酰胺凝胶对玉米幼苗叶片总蛋白分离效果的影响

2.4等电聚焦过程中不同上样量对蛋白质分辨率的影响

以传统的三氯乙酸/丙酮法(TCA)提取玉米幼苗叶片总蛋白,采用长17 cm、pH值4～7 IPG线性胶条,将蛋白样品上样量设计为500，800，1 000 μg 3个不同的梯度进行双向电泳的结果分析(图4),由PDQuest8.0软件分析可知,蛋白上样量为500 μg时,双向电泳图谱上的蛋白点数量明显较少,蛋白质点拖尾现象明显,低丰度蛋白不容易被检测从而造成丢失,影响双向电泳试验的准确性与重复性(图4-A);当蛋白上样量为800 μg时(约650个),蛋白点最多,同时蛋白点较清晰,无拖尾与条纹现象,且蛋白质点分布均匀,聚焦效果好,图谱质量佳(图4-B);在蛋白上样量为1 000 μg时,蛋白点较多,高丰度蛋白点过大,出现饱和重叠现象,掩盖了其余蛋白斑点,凝胶图谱上横竖条纹和拖尾现象明显,影响蛋白点的分离与分析(图4-C)。

上样量分别为A.500 μg;B.800 μg;C.1 000 μg。

3　讨论

3.1玉米叶片总蛋白的提取方法

随着新科技的不断向前发展,2-D分离技术已从载体两性电解质管胶发展到固相pH梯度IPG双向凝胶电泳,显著提高了2-D分离技术分离植物总蛋白的重复性与分辨率[13]。不同的植物组织中,总蛋白的提取以及双向电泳条件等一些环节需进行不断的完善、优化。

近些年,在植物的蛋白质组学研究中,通过双向电泳分离、鉴定总蛋白取得了显著成果,该技术也成为目前所应用的电泳技术中信息含量最大、分辨率最高的分离技术[14-15];因而在进行植物总蛋白样品制备时,尽可能保留较多的蛋白质种类,且不易降解。总蛋白的提取过程,包括组织破碎、溶解、变性和还原等几个主要步骤,可破坏蛋白质之间的相互作用,除去如核酸、色素等非蛋白物质[16]。本研究以酚提取法、三氯乙酸/丙酮法(TCA)及磷酸缓冲液提取法提取玉米总蛋白,对3种方法所提取的样品进行Bradford 法蛋白定量分析;随后在上样量800 μg,分离胶17 cm、pH值4～7 IPG胶条,12.5%的SDS-PAGE进行2-D分离。电泳后图谱表明,三氯乙酸/丙酮提取法(TCA)所得到的2-D凝胶图谱蛋白点最多,蛋白点呈圆形,凝胶背景干净,横竖条纹干扰少,电泳图谱质量佳。样品整个提取过程需在 4 ℃以下进行,可有效地防止总蛋白的降解。在冷丙酮和三氯乙酸沉淀总蛋白时,于提取过程中加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP),明显地减少玉米叶片中色素、酚等非蛋白物质对玉米叶片总蛋白纯度的影响。增加80%冷丙酮洗涤和沉淀过程,同时在离心时加大转速和延长离心时间,能够有效地除去总蛋白样品中的盐分,减少双向电泳中条纹干扰的现象。

3.2不同聚焦条件对双向电泳结果的影响

在进行双向电泳过程中等电聚焦与SDS-PAGE是否合理、完全,都会影响到蛋白点在凝胶横向和纵向上的分离效果[17-18]。采用双向凝胶电泳分离植物组织总蛋白中每一步都很关键,但等电聚焦的好坏显得尤为重要,聚焦能否达到平衡直接影响总蛋白的分离效果[19]。所以,双向电泳后图谱上的蛋白点形状规则、分辨率高、蛋白点数量多表明双向电泳的分离效果好。在等电聚焦过程时,温度不应超过20 ℃,聚焦过程中裂解液中含有高浓度的尿素,在温度高于37 ℃尿素分解会产生氰酸盐,可能引起蛋白质的氨基甲酰化作用,影响蛋白质的等电点[20];当聚焦总时间在30 h 左右,不同等电点的蛋白质能够较好地得到分离。聚焦结束后,胶条最好直接进行平衡,或在水化盘中于-70 ℃暂存,但不应超过72 h,以防蛋白质降解。2次平衡的时间都不宜超过15 min,但不少于10 min,时间过长会引起蛋白质发生降解,过短则蛋白质还原不完全,不利于第二向电泳的分离。通过设计4种不同的等电聚焦 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ) 条件对玉米叶片总蛋白双向电泳条件进行优化,结果表明:聚焦条件为20 000 V/h时,电泳后凝胶图谱上蛋白点较多且清晰,水平及垂直条纹少,聚焦效果最好。

3.3上样量与丙烯酰胺浓度对双向电泳结果的影响

植物蛋白质组学研究中,针对目标蛋白质的不同,应对分离胶的浓度进行适当调整。当要分离的蛋白质分子量较大时,应在进行研究该类蛋白质过程中适当减小分离胶的浓度,从而更好地分离这类蛋白质[21]。通过对玉米幼苗叶片总蛋白在10.0%，12.5% 和15.0% 3个丙烯酰胺浓度下蛋白质的分离效果鉴定;结果显示,分离玉米叶片总蛋白的分离胶浓度应为12.5%,该浓度对玉米叶片总蛋白的分离效果最佳,条带清晰、无拖尾、条纹等现象发生。

选择合适的上样量是获得高质量双向电泳图谱的关键,而过低上样量不利于低丰度蛋白点的检测,过高则得到的蛋白点甚至比过低上样量时的蛋白点更少,因为等电聚焦时蛋白质浓度过高会在胶槽中沉淀,不能很好地进入IPG胶条中[22];并且蛋白上样量增加,有利于低丰度蛋白质显现,而在蛋白上样量过高时,高丰度蛋白斑点过大,影响其他蛋白点的分离与分析。而且,蛋白样品溶液过多则不能被胶条充分吸收,会使电泳不能正常进行[23]。因此,选择合适的蛋白上样量,应根据不同的目的、方法及IPG胶条长度和pH范围确定,并且蛋白上样量的确定也应考虑蛋白质染色方法。通过采用17 cm的IPG胶条,样品蛋白上样量800 μg所获得的双向电泳图谱蛋白点最多,且蛋白点清晰,无横、竖条纹干扰,图谱质量最好。

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Two Dimensional Electrophoresis of Optimization and Extraction of Proteome Research of Maize

DONG Jing1,LU Xiaoping1,LÜ Ersuo2,XUE Chunlei1,LI Junwei1

(1.College of Agronomy,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot010019,China;2.Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences,Huhhot010031,China)

In order to establish a set of two dimensional gel electrophoresis technique for maize,the effects of three kinds of total protein extraction methods on the results of two dimensional electrophoresis of maize were studied.Meanwhile,the protein sample volume,condition of isoelectric focusing and the density of polyacrylamide gel were explored and optimized.The results showed that TCA-acetone for total protein extraction was simple and convenient compared with the method of phenol extraction and phosphate Buffer (PB) solution method.The 2-D maps had abundant protein spots and more clear background,this study established a suitable proteomics methods for forage maize.Meantime,it screened out the first dimension electrophoresis was performed on the sample 800 μg and focus conditions 20 000 V/h;The second electrophoresis was performed on 12.5% polyacrylamide gels,it could be obtained two-dimensional electrophoresis map at 17 cm of background low and higher resolution.Optimization system would be suitable for two dimensional electrophoresis of total protein of forage maize leaves,the method can be applied to corn leaf proteome analysis of sample extraction.The useful information can be provided for the proteomics research of maize.

Maize;Leaf;Protein extraction;Two-dimensional electrophoresis (2-D)

2016-04-11

内蒙古自治区科学技术项目(20131410);内蒙古呼和浩特科学技术项目(2013-重-计-1)

董婧(1989-),女,内蒙古呼和浩特人,在读博士,主要从事植物遗传育种研究。

逯晓萍(1960-),女,内蒙古呼和浩特人,教授,博士,博士生导师,主要从事植物遗传育种研究。

S513.03

A

1000-7091(2016)04-0013-06

10.7668/hbnxb.2016.04.003