白　辉,李志勇,王永芳,石　灿,刘　磊,全建章,董志平

(河北省农林科学院 谷子研究所,国家谷子改良中心,河北省杂粮研究实验室,河北 石家庄　050035)



谷子糯质基因共分离分子标记的研究

白辉,李志勇,王永芳,石灿,刘磊,全建章,董志平

(河北省农林科学院 谷子研究所,国家谷子改良中心,河北省杂粮研究实验室,河北 石家庄050035)

为得到一种鉴别糯质谷子的分子标记方法,用于优质谷子糯质资源的利用及糯质品种的选育。通过对糯性谷子十里香与梗性谷子豫谷1号配制的F2群体的F3种子胚乳进行碘液检测,结果显示:深蓝色与棕红色胚乳单株数的比例符合3∶1,说明糯质对梗质是由单基因控制的隐性性状。利用糯质分型引物对十里香基因组进行PCR扩增和产物测序,结果表明,十里香的糯性是由Ⅳ型糯质基因控制,即由TSI-2转座子插入到淀粉合成酶基因(Si006103m)内元1形成。根据该糯质基因设计出2对InDel标记引物waxy-TSI2/int1和waxy-int1-1F/4R,扩增谷子基因组DNA,若waxy-TSI2/int1引物组合能扩增出984 bp的扩增片段,并且waxy-int1-1F/4R引物组合不能扩增出540 bp的扩增片段,则该材料为含Ⅳ型糯质基因的糯质谷子。最后,利用该标记组合从100份谷子资源中鉴定到2份属于Ⅳ型糯质基因控制的糯质材料。可见,该标记组合可以准确鉴别谷子Ⅳ型糯质基因。

谷子;糯质基因;分子标记;共分离

谷子,脱壳后称小米,是一种营养丰富的食品,经常食用小米对维持蛋白质、氨基酸的代谢平衡均有重要的作用。小米主要物质为淀粉,含量在75%左右,一般品种直链淀粉含量在12.8%以上,糯性品种直链淀粉含量为1.24%～7.00%。糯小米粒小,色淡黄或深黄,质地较硬,糯小米淀粉分子量比普通小米小20多倍,食用消化率比普通小米高20%以上,在国外糯小米也被评为“营养之王”而列为“保健食品”。它还具有较高的粘滞性和良好的适口性,制成品有甜香味。加温处理的糯小米淀粉具有较高的膨胀力和透明性,这些优良特征赋予糯小米宝贵的价值和广泛的用途[1-3]。

分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种新的较为理想的遗传标记形式,近十几年来发展非常迅速[4-6]。随着现代生物技术的发展,分子标记已经在遗传育种改良研究中得到了广泛的应用[7-17]。分子标记技术可以直接从分子水平对目标性状进行选择,结合田间表型选择,可明显提高对目标性状选择的准确性,从而加快选育优秀品种的进程,缩短育种周期,降低育种成本。因此,分子标记技术已成为作物遗传育种最重要的辅助手段之一。

十里香系优质糯性谷子资源,但其他农艺性状很差。豫谷1号系获国家发明奖的优良谷子品种,梗性品质。由豫谷1号×(1066A不育材料×十里香)F4复合杂交选育而成的冀创1号(河北省农林科学院谷子研究所植保室选育),是高产、优质糯性品种,其直链淀粉含量(占样品干质量)仅1.22%,在国内谷子糯质品种中含量处于最低水平,表明其为高糯质品种[18]。目前已经制成糯小米酒、糯小米醋、糯小米乳和粘糕等具有糯质特色的小米加工产品。

冀创1号的选育过程历经15年,但是分子标记技术能够对目标基因进行快速选择,为高效育种提供了非常有效的工具[8-11,19]。如果再以目标基因间的差异作为标记,可有效地避免分子标记与目标基因连锁互换的问题,同时可以在苗期进行选择,用PCR技术对DNA的质量要求不高,而且实用性很强,从而明显缩短了育种周期,也提高了选择效率。为此,本试验开发了可以对糯质性状进行基因型鉴定的共分离分子标记,为建立谷子糯质基因鉴定的技术体系奠定了基础,既明显提高谷子糯质育种进程,又促进谷物产业化发展。

1　材料和方法

1.1植物材料

谷子优质糯性资源十里香、梗质品种豫谷1号及其杂交后代F1、F2(400株)材料均由河北省农林科学院谷子研究所植保室保存。谷子种质资源中100份记录为糯质的谷子材料,原产地包括河北、河南、北京、天津、湖北、甘肃、山西等地区,上述材料为河北省农林科学院谷子研究所植保室收集保存。

1.2糯质性状鉴定

F2中每份谷子材料随机选取成熟籽粒15粒,分别置于小研钵中用杵子捣碎,加碘-碘化钾溶液 30 μL,混匀样品和溶液,观察胚乳中淀粉颜色的变化。

100份记录为糯质的谷子材料中,每种材料各取5粒种子进行碘液染色,如果蓝色与棕红色都出现,则再随机选择5粒进行染色观察。

1.3基因组DNA的提取及PCR扩增

采用CTAB法[20]提取谷子叶片基因组DNA。NanoDrop ND-2000C测定其浓度,将样品浓度稀释为100 ng/μL。

waxy-TSI2/int1标记的引物核苷酸序列是:上游引物5′-GAAGTGGAGGATACTGATGGG-3′,下游引物5′-GGATTTGACTGCATGAAAATG-3′;waxy-int1-1F/4R标记的引物核苷酸序列是:上游引物5′-CCGTTTCGGTCGGTAGGAAG-3′,下游引物5′-AGTG GGTTCGATGTTTGAAC-3′。

以提取的基因组DNA为模板,按下列反应体系进行PCR:

引物对waxy-TSI2/int1和引物对waxy-int1-1F/4R的PCR反应体系(20 μL)为:100 ng基因组DNA模板2 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL、10×PCR Buffer 2 μL、10 μmol/L上下游引物各2 μL，TaqDNA聚合酶 0.3 μL，补纯水至20 μL。PCR扩增程序为:95 ℃,4 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 35～60 s,35个循环;72 ℃,延伸10 min。

引物对ex1/ex2、ex2int2/ex4r、M5/R7和M7/R10的PCR反应体系(20 μL)为:100 ng基因组DNA模板2 μL、2.5 μmol/L dNTPs 3.2 μL、10× LA PCR Buffer Ⅱ(Mg2+Plus)2 μL、10 μmol/L 上下游引物各2 μL，LATaqDNA聚合酶 0.2 μL，补纯水至20 μL。PCR扩增程序为:94 ℃ 1 min;98 ℃ 15 s,68 ℃ 10 min,30个循环;72 ℃延伸10 min。1.2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

2　结果与分析

2.1糯质遗传分析群体

从谷子种质资源中选出优质糯谷子十里香,将其与梗质谷子品种豫谷1号配制正反交杂交组合F1。收获正反交F1后再自交,构建糯质基因的F2分离群体,在五叶期之前取叶片以提取基因组DNA,并收获F3种子。利用I2-KI溶液对400份F2单株的种子胚乳中淀粉进行颜色反应,碘遇直链淀粉变深蓝色,否则变棕红色。F3种子胚乳颜色出现深蓝色和棕红色的分离,包括3种情况:15个籽粒胚乳全部变蓝,全部变棕红色,或者部分蓝色部分棕红色,蓝色明显多于棕红色,如表1所示。F3种子的胚乳性质由F2基因型决定,出现深蓝色胚乳的单株数与棕红色胚乳单株数的比例符合3∶1,说明糯质对梗质是由单基因控制的隐性性状。

表1　F2梗糯表型统计表

2.2十里香糯质基因型的鉴定

Kawase等[21-23]认为糯质基因waxy是由于转座子插入到基因GBSS1(编码颗粒凝结型淀粉合成酶)后,造成基因低表达或不表达从而减弱或丧失功能引起的。根据插入的转座子类型及插入位点的不同,糯质基因可以分为7种类型。根据文献[21]提供的区分糯质类型的4对引物序列(ex1与ex2、ex2int2与ex4r、M5与R7、M7与R10,序列未附),合成该4对引物,分别在亲本十里香和豫谷1号基因组DNA中进行PCR扩增(图1),只有ex1/ex2引物组合对谷子父本糯质十里香与母本梗质豫谷1号的基因组DNA扩增产物不同(其他3组引物扩增产物均相同),前者扩增片段在5 kb左右,后者扩增片段是828 bp。通过对父本PCR产物部分测序证实,扩增片段序列与gi|62318482|dbj|AB210215.1| Setaria italica GBSS1 gene,transposable element TSI-2 in intron 1完全匹配,说明十里香属于Ⅳ型糯质基因[24],是由TSI-2转座子插入到淀粉合成酶基因(Si006103m)内元1形成的,TSI-2转座子大小是5 251 bp。

2.3谷子Ⅳ型糯质基因共分离分子标记的开发

利用转座子TSI-2序列和Si006103m内元1序列,设计1对InDel标记引物waxy-TSI2/int1,可以鉴别出Ⅳ型糯质纯合隐性和杂合显性基因型;利用TSI-2插入位点所在的内元1序列,又设计了1对InDel标记引物waxy-int1-1F/4R,可以鉴别梗质纯合和杂合基因型,即2对引物同时使用能够排除Ⅳ型糯质基因型中杂合基因型的干扰(图2)。waxy-TSI2/int1标记引物能够在父本十里香中扩增出984 bp条带,母本豫谷1号中没有扩增条带;waxy-int1-1F/4R标记引物能够在母本中扩增出540 bp条带,父本中没有扩增条带。如果使用该2组InDel标记引物检测谷子DNA,waxy-TSI2/int1引物能扩增出984 bp条带,waxy-int1-1F/4R引物不能扩增出条带,说明该谷子是含有纯合Ⅳ型糯质基因的糯性材料(表2)。此外,2对标记扩增结果一有一无,增加了结果的可靠性和准确性。

M.DL2000 Marker;P1.父本十里香;P2.母本豫谷1号。M.DL2000 Marker;P1.Shilixiang;P2.Yugu 1.

黑框.Si006103m基因的外元;黑线条.Si006103m基因的内元。

表2　共分离InDel标记的基因型与表现型列表

注:+.标记引物能扩增出条带;-.标记引物不能扩增出条带。

Note:+.The labeled primers could amplify bands;-.The labeled primers couldn′t amplify bands.

2.4共分离标记在F2中的检测

利用CTAB方法提取十里香与豫谷1号的400份F2各单株的基因组DNA,利用2组InDel标记引物进行PCR,扩增产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳分析,部分检测结果如图3所示,发现该标记与糯质性状共分离,能对糯质隐性基因型、梗质纯合和杂合显性基因型进行准确鉴别。标记基因型为WxWx,F3种子胚乳中淀粉遇碘全部变深蓝色;标记基因型为Wxwx,籽粒淀粉遇碘变蓝或棕红色,比例为3∶1;标记基因型为wxwx,籽粒淀粉遇碘全部变棕红色,与十里香表现完全一致。标记基因型WxWx∶Wxwx∶wxwx符合1∶2∶1的分离比例。

M.DL2000 Marker;P1.父本十里香;P2.母本豫谷1号;1～14.F2的部分单株;上板是waxy-TSI2/int1检测结果;下板是waxy-int1-1F/4R检测结果。

M.DL2000 Marker;P1.Shilixiang;P2.Yugu 1;1-14.Some single plants from the F2;The upper plate is the detection result of waxy-TSI2/int1;The lower plate is the detection result of waxy-int1-1F/4R.

图3标记引物waxy-TSI2/int1和waxy-int1-1F/4R对F2扩增产物的电泳结果

Fig.3The electrophoresis result of PCR products amplified by the F2using the waxy-TSI2/int1 and waxy-int1-1F/4R primers

2.5共分离标记在谷子资源中的检测

利用本试验开发的共分离标记对收集的100份谷子材料进行了分析,部分检测结果如图4所示,其中只有2份材料利用waxy-TSI2/int1标记引物能够扩出984 bp的扩增片段,而利用waxy-int1-1F/4R标记引物没有扩增产物,并且这2份材料的种子胚乳经碘液检测全部变为棕红色,说明这2份材料属于Ⅳ型糯质基因控制的糯质材料。可见,该标记组合可以准确鉴别Ⅳ型糯质基因。

3　讨论

谷子的Waxy基因编码颗粒凝结型淀粉合成酶(GBSS1),决定谷子胚乳和花粉中的直链淀粉合成。普通谷子(WxWx)籽粒中的淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成。糯谷子(wxwx)籽粒中含有少量或不含直链淀粉,几乎全部由支链淀粉组成[21,25]。因为不同转座子[22]插入GBSS1基因序列的不同位点,Waxy基因突变成各种不同的等位基因,减弱或消除了GBSS1基因的表达,对其编码蛋白颗粒凝结型淀粉合成酶的酶活影响为5%～95%,从而形成糯质(waxy)或低淀粉含量(Low-amylose)性状[21]。根据插入的转座子类型及插入位点的不同,糯质基因可以分为7种类型,插入转座子的大小从1～9 kb不等,插入位点也包括了内元区或外元区[21]。

经过15年的传统育种试验工作,河北省农林科学院谷子所植保室将谷子资源十里香的优质糯性完全转移到高产、农艺性状优良的育成品种冀创1号上,目前,后者以其优质的糯性在食品加工领域潜力无限[13]。为了更好更快地将该糯性基因应用到育种领域,培育更多的优质糯性品种,进行了分子标记辅助选择育种的尝试。基于十里香含有Ⅳ型糯质基因,本试验的目的就是开发一种基于PCR的实用经济型标记,可以有效地从谷子材料中鉴定出含Ⅳ型糯质基因的糯质谷子,用于谷子糯质资源的利用及糯质品种的选育,所开发标记为waxy-TSI2/int1和waxy-int1-1F/4R。用这2对特异扩增谷子糯质基因的共分离InDel标记引物扩增谷子的基因组DNA,若waxy-TSI2/int1引物组合能扩增出984 bp的扩增片段,并且waxy-int1-1F/4R引物组合不能扩增出540 bp的扩增片段,则该材料为含Ⅳ型糯质基因的糯质谷子。2对标记扩增结果一有一无,增加了结果的可靠性和准确性。由于该标记是基于Ⅳ型糯质基因而设计的共显性分子标记,可以进行基因型鉴定,即可以对糯质纯合基因型和梗质杂合基因型进行鉴别。该InDel标记的优点还在于对PCR模板质量要求不高,对TaqDNA聚合酶要求不高,只要能扩增出条带即可。

此外,谷子种质资源库中记录的糯质资源大部分都是通过手搓籽粒的感觉和经验来判断,并没有严格的标准,利用I2-KI溶液检测糯质资源籽粒时发现部分材料是梗质或杂合不纯,结果在本研究中也证实了这一点。另外,I2-KI溶液检测方法只能判断出该品种是糯或梗,具体糯质类型并不能判断,所以也不好加以利用;而且,在选育糯质品种时杂交当代不稳定,种子数量有限,如果利用I2-KI直接来筛选非常不可取。所以,开发优质糯性基因的分子标记作为糯质资源筛选或糯质品种选育的辅助手段,既方便简单,又缩短了常规育种的时间[18,26]。

M.DL2000 Marker;P1.父本十里香;P2.母本豫谷1号;1～2和17～29.糯质谷子;3～16.梗质谷子;30～31.不纯谷子;上板是waxy-TSI2/int1检测结果;下板是waxy-int1-1F/4R检测结果;1～2.共2份糯质材料带型一致,含有Ⅳ型糯质基因;3～16.共14份梗质材料带型一致;17～27.共11份糯质材料没有扩增条带；28～29.共2份糯质材料带型一致,均不含Ⅳ型糯质基因;30～31.共2份不纯材料带型一致,均是杂合子基因型。

M.DL2000 Marker;P1.Shilixiang;P2.Yugu 1;1-2 and 17-29.Waxy foxtail millet;3-16.Non-waxy foxtail millet;30-31.Impure foxtail millet;The upper plate is the detection result of waxy-TSI2/int1;The lower plate is the detection result of waxy-int1-1F/4R;1-2.2 waxy materials containing the type Ⅳwaxygene;3-16.14 non-waxy materials with the same bands;17-27.11 waxy materials without bands；28-29.2 waxy materials with the same bands,both of them don′t contain the type Ⅳwaxygene;30-31.2 impure materials containing the heterozygouswaxygene.

图4标记引物waxy-TSI2/int1和waxy-int1-1F/4R对31份谷子材料扩增琼脂糖凝胶电泳结果

Fig.4The agarose electrophoresis result of PCR products amplified by the thirty-one materials of foxtail millet using the waxy-TSI2/int1 and waxy-int1-1F/4R primers

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Research on Co-segregated Molecular Markers of waxy Gene in Foxtail Millet

BAI Hui,LI Zhiyong,WANG Yongfang,SHI Can,LIU Lei,QUAN Jianzhang,DONG Zhiping

(Institute of Millet Crops,Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences,National Foxtail Millet Improvement Center,Minor Cereal Crops Laboratory of Hebei Province,Shijiazhuang050035,China)

The study provided a molecular marker technology to identify the waxy foxtail millet,which could be used to utilize the excellent waxy resources of foxtail millet and to breed the waxy varieties.Firstly,through the iodine solution detection of the F3seeds endosperm from F2constructed from the hybridization of waxy foxtail millet,Shilixiang,and non-waxy foxtail millet,Yugu 1.Results showed that the ratio of plant numbers with dark blue and brownish red endosperm was 3∶1,indicated that the waxy phenotype was a recessive trait controlled by a single gene.Then using waxy genotyping primers,the genomic DNA of Shilixiang was amplified by PCR and the products were sequenced.The results showed that the waxy trait was controlled by a Ⅳ type waxy gene,namely a TSI-2 transposon was inserted into the first intron of the starch synthase gene (Si006103m).Therefore,the InDel molecular markers,waxy-TSI2/int1 and waxy-int1-1F/4R,were developed based on the gene sequence of Si006103m,and then the genomic DNA of foxtail millet was amplified by them.If there was an product with 984 bp amplified by the waxy-TSI2/int1 primer and no product with 540 bp amplified by the waxy-int1-1F/4R primer,the material was identified as a waxy foxtail millet containing the type Ⅳwaxygene.Furthermore,we identified 2 waxy materials controlled by the Ⅳ typewaxygene from 100 foxtail millet resources using two pairs of waxy primers.Therefore,the InDel markers can be used to accurately identify the Ⅳ typewaxygene from foxtail millet.

Foxtail millet;waxygene;Molecular marker;Co-segregated

2016-03-11

国家现代谷子糜子产业技术体系建设项目(CARS-07-12.5-A8);科技部“十二五”农村领域国家科技计划课题(2011BAD06B01-1)

白辉(1980-),女,河北石家庄人,副研究员,博士,主要从事谷子抗病分子生物学研究。

董志平(1964-),女,河北邢台人,研究员,硕士,主要从事谷子病害研究。

全建章(1964-),男,河北石家庄人,研究员,硕士,主要从事谷子种质资源和育种研究。

S515.03;S326;Q78

A

1000-7091(2016)04-0007-06

10.7668/hbnxb.2016.04.002