张璐，徐晋暤，麻锦彪



一种结合SELEX与二代测序技术筛选RNA结合蛋白特异识别序列新方法的建立

张璐，徐晋暤，麻锦彪

复旦大学 生命科学学院生物化学系 遗传工程国家重点实验室，上海 200438

RNA结合蛋白通过特异识别RNA底物发挥重要的生物学作用。指数富集的配体系统进化 (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX) 技术是一种体外筛选核酸底物的基本方法，SELEX技术通过重复多轮筛选从随机核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸底物，本研究将利用该技术与二代高通量测序 (NGS) 相结合，体外合成含有20个随机碱基的RNA文库，将所要研究的蛋白构建到带有可被链亲和酶素磁珠捕获的SBP标记的载体上去，显著提高筛选效率，仅需1轮筛选即可获得所需RNA底物motif。通过该方法获得了人的hnRNP A1的UP1结构域特异识别AGG和AG二种RNA序列，并通过EMSA实验证实其可以与获得的RNA motif结合。这一方法的建立对于研究RNA结合蛋白识别底物的序列特异性，并进一步了解其在生物体内的调控机制有重要意义。

SELEX，高通量测序技术，hnRNP A1，RNA motif

SELEX技术是Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment的缩写，即指数富集的配体系统进化技术。该技术根据DNA/RNA结合蛋白的能力，从随机的DNA/RNA文库中找到高亲和力的DNA/RNA[1-3]。1990年，Tuerk等[4]应用该技术从人工构建的随机寡核苷酸文库中筛选到能特异性结合噬菌体T4 DNA聚合酶的寡核苷酸配体。这项技术自1990年发现至今，已经应用于多种不同靶物质的筛选[5-6]。传统的SELEX技术的主要技术流程是：体外化学合成一个寡核苷酸文库，再与靶蛋白混合，形成蛋白-核酸复合物，洗去未与靶蛋白结合的核酸，分离与靶蛋白结合的核酸并扩增，重复多轮的筛选，最后构建克隆文库，挑取50–100个克隆测序，分析数据才能获得最适核酸配体。……