陈芳霞，陈鹏



热敏型核酸酶在毕赤酵母中的分泌表达及催化特性

陈芳霞，陈鹏

西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌 712100

核酸酶在生物工程领域有着重要的应用价值。本研究在优化北极虾核酸酶 (Shrimp nuclease，SNU) 基因序列的基础上，构建SNU的毕赤酵母分泌表达载体SNU-pPICZα A并转化酵母，以高拷贝整合转化子为基础，优化酶表达的条件，并对该酶的催化特性进行分析，结果显示SNU可在毕赤酵母SMD1168H中高效分泌表达，最佳诱导表达条件为：培养基BMMY pH 6.0，甲醇浓度为1%，诱导时间为72 h，诱导后粗酶液比活力为1.4×105U/mL。经过DEAE Sephadex阴离子交换层析可纯化获得高纯度的目标蛋白，每升菌液可纯化15 mg目标蛋白，比活力达到6.291×106U/mg，该酶表观分子量为50 kDa，PNGaseF酶切证实该酶存在糖基化现象。二价金属离子Ca2+、Mn2+、Co2+、Mg2+及还原剂DTT、β-ME能显著地提高其水解活性，但Zn2+、Cu2+、SDS、高浓度NaCl抑制该酶的活性，SNU为Ca2+/Mg2+依赖型核酸酶。70 ℃处理10 min可使该酶不可逆的失活。

北极虾Ca2+/Mg2+依赖型核酸酶，毕赤酵母，分泌表达优化，催化特性

重组蛋白技术的成熟与发展为生物医药和生物学研究提供了非常高效的手段，但在蛋白生产过程中仍存在诸多技术性难题。在重组蛋白纯化过程中菌体裂解释放核酸产生高粘度的裂解液，影响下游的操作和层析纯化。蛋白粗提液过量的核酸将导致纯化产品的核酸污染，因此在蛋白纯化上游步骤除去核酸意义重大。酶法除去核酸是现今蛋白质粗提液处理最主要的途径。商业化产品DNase I是最为常用的去除核酸的酶制剂[1]，但存在催化活力低、价格昂贵等缺点，来源于灵杆菌商品化核酸酶Benzonase endonuclease (Merck) 由于具有高的催化效率，使之成为生物化学和药物制剂领域重要的核酸污染控制用酶[2-4]。……