李海花，张　蕾，陈龙宾，朱　琪，乔家运，王文杰

（天津市畜牧兽医研究所，天津 300381；天津市畜禽健康养殖技术工程中心，天津300381）

黑曲霉中单宁酶基因的克隆表达及酶学特性分析

李海花，张蕾，陈龙宾，朱琪，乔家运，王文杰

（天津市畜牧兽医研究所，天津 300381；天津市畜禽健康养殖技术工程中心，天津300381）

本试验旨在从一株黑曲霉中克隆单宁酶基因，并研究其酶学性质。利用前期分离的一株黑曲霉菌株SL-5，克隆出单宁酶基因，基因全长1533 bp，编码510个氨基酸；使用大肠杆菌BL21作为宿主，并使用pET32a（+）作为表达载体，实现了单宁酶基因在大肠杆菌中的表达。纯化的单宁酶能够降解单宁，酶的最适反应温度为40℃，最适反应pH为6.0。

单宁；单宁酶；大肠杆菌；克隆；表达

［Abstract］This study was conducted to clone tannase gene from Aspergillus niger and investigate its tannin-degrading characterization.We cloned the tannase gene from Aspergillus niger（SL-5），and the open reading frame of the gene contained 1533 bp coding for a 510 amino-acid matured protein，and expressed the tannase protein（rTannase）in Escherichia coli by using pET32a（+）vector.We found that the purified tannase was able to degrade hydrolysable tannin，exhibiting optimal enzyme activity at 40℃and pH 6.0.

［Key words］tannins；tannase；Escherichia coli；cloning；expression

单宁广泛分布于植物的各部位，如树叶、树皮、树干和种子。根据其结构和特性，通常分为水解单宁和缩合单宁 （Khanbabaee和 van Ree，2001）。饲料中高浓度的单宁会降低反刍动物的生产性能和饲料转化效率，通常使用聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮这两种化学物质去除单宁的危害（Ephraim等，2005），但通常处理成本较高。单宁酶 （E.C.3.1.1.20）能切割水解单宁之间的酯键（Battestin和Macedo 2007），某些微生物能分泌单宁 酶（Böer等 ，2009；O'Donovan和 Brooker，2001）。但是，由于单宁酶的产量较低，而且生产条件苛刻，限制了其在饲料中的应用。因此，采用基因工程技术提高单宁酶的产量有重要意义。

本研究使用实验室前期分离到的一株能降解单宁的黑曲霉菌株SL-5（乔家运等，2011），克隆其中含有的单宁酶基因，并实现在大肠杆菌中的表达。

1　材料与方法

1.1菌株、载体和工程菌黑曲霉SL-5菌株为本实验室分离，用于基因组DNA的提取。……