刘典晓　王玉玖　刘宝辉　李　伟

滨州医学院附属医院心脏外科　滨州　256603



逆向分段采取法对大隐静脉内皮细胞的保护作用的研究*

刘典晓王玉玖刘宝辉李伟

滨州医学院附属医院心脏外科滨州256603

目的观察逆向分段采取法对大隐静脉内皮细胞的保护作用及远期效果。方法将家兔分为4组，即结扎后0 min(对照组)，30 min(I组)，60 min(II组)，120 min(III组)，检测其单位面积内皮细胞合成与释放一氧化氮(NO)、PCNA的表达及增殖指数、细胞凋亡指数和血管管腔直径等。结果与对照组比较，I、II组各项指标与对照组无统计学差异(P>0.05)，III组与对照组差别有统计学意义。结论逆向分段采取大隐静脉可以有效保护内皮细胞，提高血管通畅率。

逆向分段方法；大隐静脉；血管内皮细胞；血管通畅率

目前冠心病已成为严重危害人类健康的疾病之一，其发病率逐渐升高，发病年龄呈下降趋势[1]。冠脉搭桥术仍为治疗冠心病的有效手段，且冠脉搭桥术次数呈上升趋势。自体大隐静脉是冠状动脉旁路移植术(CABG)中最常用的移植材料。然而，静脉移植物的再狭窄是远期面临的常见问题。据报道，静脉血管桥术后第一年再狭窄率约是20%，以后每年以2%～4%的比率递增，其十年通畅率约是40%～50%[2]。内皮细胞损伤是再狭窄的主要原因[3]。我们通过建立家兔静脉移植动物模型探讨逆向分段采取对大隐静脉内皮细胞的保护作用及远期效果。

1　材料与方法

1.1实验动物成年家兔(山东实验动物中心提供)24只，雌雄不限，体质量为2 500～3 000 g。

1.2动物模型建立24只家兔随机分为4组。用1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)耳缘静脉注射麻醉后，颈前及腹股沟脱毛备皮。首先游离出右侧颈总动脉长约2.5 cm备用。然后在右侧腹股沟开始向膝关节方向游离大隐静脉。游离完成后在近端同时结扎大隐静脉，用温罂粟碱纱布湿敷。分别在结扎后的0 min(对照组)，30 min(I组)，60 min(II组)，120 min(III组)剪取大隐静脉长约2.5 cm，立即剪取约0.5 cm长血管行内皮细胞合成与释放一氧化氮(NO)检测。其余大隐静脉与颈总动脉用8-0 prolene线行端端吻合。半年后行彩超检测颈总动脉桥血管通畅情况及血流速度等。兔处死后取下该段大隐静脉进行检测。

1.3病理组织学检测取血管标本，行HE染色和Weigert氏法弹性纤维染色，光镜下观察移植后内膜及中膜的组织学变化。

1.4内皮细胞NO释放量的测定分别在大隐静脉结扎后0 min、30 min、60 min、120 min取下大隐静脉并剖开，剪取1 cm×0.5 cm大小，用硝酸还原酶法测定单位面积内皮细胞合成与释放NO。

1.5PCNA的表达及增殖指数的检测将饲养6个月的家兔处死后，取移植段血管经石蜡包埋后切片，以PCNA单克隆抗体常规SABC染色，苏木精复染。计算每个高倍镜视野下PCNA阳性细胞数及细胞总数，取平均数计算细胞增殖指数。细胞增殖指数=PCNA阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.6凋亡细胞的检测应用DNA片段末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。每个标本随机选取4个部位，计算每个高倍镜视野下TUNEL阳性细胞及细胞总数，取平均值计算细胞凋亡指数。细胞凋亡指数=TUNEL阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.7超声检查测量管腔直径及观察血管通畅情况。

2　结果

2.1一般情况各组家兔切口无感染，愈合良好。移植血管与周围组织间粘连，各组移植血管搏动良好，管腔扩张，管壁不同程度增厚，无血肿及血管瘤出现。切开移植血管见血管壁内膜光滑，远近端吻合口通畅，无血栓形成。

2.2单位面积内皮细胞合成和释放NO的量与对照组比较，各实验组NO释放量未有明显变化(P>0.05)(见表1)。

2.3组织学观察对照组内膜光滑，内皮细胞相对完整，中膜由薄层平滑肌及胶原纤维、弹力纤维构成，外膜为结缔组织。移植后各组内膜及中膜均有增厚，有少量单核细胞和淋巴细胞浸润，但III组中膜增厚明显，且有内皮细胞缺失(见图1)。

表1　各组单位面积内皮细胞合成和释放NO的量

2.4术后6个月血管壁PCNA表达及增殖指数术后6个月各组静脉血管中膜平滑肌细胞PCNA染色阳性。细胞核呈棕褐色为阳性细胞。各组移植血管中膜平滑肌均有不同程度的PCNA表达。与对照组比较，I、II组细胞增殖指数与对照组无明显差别(P>0.05)，III组细胞增殖指数与对照组之间差别有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

2.5细胞凋亡指数与对照组比较，I、II组内皮细胞凋亡指数与对照组无明显差别(P>0.05)，III组凋亡指数与对照组之间差别有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

表2　各组移植段血管平滑肌细胞增殖指数及凋亡指数

注：与对照组比较，*P<0.05

2.6超声检查测量情况各组移植段血管均保持通畅，且管腔直径和血流速度相当，差别无统计学意义(P>0.05)(见表3)。

3　讨论

冠脉搭桥术后大隐静脉远期再狭窄是困扰心外科医师及患者的难题之一。研究表明大隐静脉血管内皮的损伤及功能障碍是影响其远期通畅率的主要因素[2]。国内外已经有大量关于大隐静脉内皮细胞保护的相关研究，主要包括微创操作[4]、减轻机械损伤、改进保存液[5]、血管外支架[6]、基因技术等。

NO是血管内皮细胞分泌的强效血管舒张因子，可以扩展至血管的平滑肌细胞，使血管舒血管反应性增强，能有效抑制细胞增生、血小板聚集、白细胞粘附。血管内皮细胞损伤可导致NO合成与释放量降低，NO的合成与释放量反映内皮细胞的受损程度。本实验发现I、II、III组各组血管内皮NO的合成与释放量均与对照组无差别，说明逆向分段采取获得大隐静脉能有效保护血管内皮细胞。内皮细胞损伤后平滑肌细胞增殖与迁移是血管再狭窄的核心机制[7]。内皮细胞损伤后，前列环素和NO分泌减少，从而刺激细胞增生并迁移至内膜，同时刺激基质、胶原和蛋白多糖的合成，逐渐导致血管的再狭窄。通过逆向分段的方式获得大隐静脉，在大隐静脉离体前管腔内一直处于血液充盈状态，最大程度地减少缺血时间及避免离体后其他保存液体对内皮细胞的损害，有效保护内皮细胞的功能。本实验移植后6个月的取材组织学检查发现I、II组血管壁结构与对照组无明显差别，并且血管中膜平滑肌增殖指数及内皮细胞凋亡指数均与对照组无明显差别，说明内皮细胞保护效果满意，为提高远期通畅率奠定基础；但我们在III组也观察到血管壁中膜增厚明显，且有内皮细胞缺失，说明结扎时间过长对于内皮细胞保护功能下降，其发生机制需要进一步研究。在移植后6个月的超声检查中发现I、II、III组血管管腔直径及血流速度与对照组均无明显差别，说明逆向分段获得大隐静脉移植后远期血管通畅情况可靠，效果满意。III组虽然组织学检查发现中层增厚明显且有内皮缺失，但并未影响其管腔直径及血流速度，可能与移植术后观察时间短有关。

综上所述，逆向分段采取大隐静脉可有效保护血管内皮细胞，提高血管的通畅率。将该方法与其他保护方法联合应用可能会进一步提高保护效果。

[1] Wagner R,Piler P,Gabbasov Z,et al.Adjuvant cardioprotection in cardiac surgery: update[J].Biomed Res Int,2014,2014:808096.

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[3] Silber S,Colombo A,Banning A P,et al.Final 5-year results of the TAXUS II trial: a randomized study to assess the effectiveness of slow- and moderate-release polymer-based paclitaxel-eluting stents for de novo coronary artery lesions[J].Circulation,2009,112(15):1498-1504.

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Protective effect of reverse segmentation method harvesting saphenous vein on ascular endothelial cell

LIU DianxiaoWANG YujiuLIU BaohuiLI Wei

Department of Cardiovascular Surgery,Binzhou Medical University Hospital,Binzhou 256603, P.R.China

ObjectiveTo observe the protective effect of reverse segmentation method harvesting saphenous vein on great saphenous vein endothelial cells, and evaluate long-term the efficacy of this method.MethodsTwenty rabbits were randomly divided into four groups:control (0 min)group，I(30 min) group，II(60 min) group and III(120 min) group.Expression levels of NO and PCNA,index of incremental and apoptosiswere observed by Elisa or pathological technique respectively. Vernier caliper was performed to measure Vascular lumen diameter.ResultsCompared with those in control group, group I and group II showed no statistically significant (P>0.05), group III showed statistically significant.ConclusionReverse segmentation method harvesting saphenous vein has protective effects on vascular endothelial cell and improve vascular patency rate.

reverse segmentation method,great saphenous vein， vascular endothelial cell,vascular patency rate

滨州市科技计划(2011ZC0912)；滨州医学院科技计划(BY2011KJ010)

王玉玖，E-mail：yujiuwang@126.com

R654.3

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1001-9510(2016)04-0248-03

2015-12-21)