董凯锋,安　娜,李东乐,邓汉森,车建途,*

(1.北京威力格生物科技有限公司,北京 102200;2.山西水塔醋业股份有限公司,山西太原 030404)



水塔老陈醋大曲酵母的分离鉴定及产乙醇和乙酸乙酯特性

董凯锋1,2,安娜1,2,李东乐1,2,邓汉森1,车建途1,2,*

(1.北京威力格生物科技有限公司,北京 102200;2.山西水塔醋业股份有限公司,山西太原 030404)

采用传统分离培养方法,从水塔老陈醋大曲中分离纯化出21株酵母菌,利用26S rDNA D1/D2序列分析方法结合形态学特征,对分离纯化的酵母菌进行鉴定,并用其发酵糯米糖化液,用静态顶空-气质联用的方法测定发酵后乙醇和乙酸乙酯的含量。结果发现:21株酵母菌鉴定结果为2株弗比恩酵母(Cyberlindnerafabianii),8株扣囊复膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)、6株异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)、3株葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)、2株东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)。21株菌株发酵后产物乙醇和乙酸乙酯的含量存在较大差别,其中产生乙酸乙酯和乙醇最多的菌株分别为异常威克汉姆酵母m12(含量为4.4415 g/L)和扣囊复膜酵母q25(含量为48.577 g/L);产生最少的则分别为扣囊复膜酵母q6(含量为0.0037 g/L)和东方伊萨酵母q12(含量为11.4555 g/L)。提示老陈醋大曲中不同种类的酵母菌在发酵中对乙醇和乙酸乙酯具有不同的贡献。

老陈醋大曲,酵母菌,静态顶空-气质联用,乙醇,乙酸乙酯

山西老陈醋历史悠久,风味独特,是我国的四大名醋之一。老陈醋酿造过程中大曲起到了关键作用。大曲是经过长期驯化,多种微生物彼此共存、顺序生长和代谢互补的微生物群体[1]。从大曲中筛选优势功能菌株,再将其应用于改善大曲的微生物群落结构是优化老陈醋大曲的重要措施之一。山西老陈醋相关的微生物研究多集中于产酸功能菌、红曲霉、高糖化酶菌株,未见用分子生物学技术和传统方法结合研究大曲中酵母菌的报道[2-5]。酵母菌是老陈醋酿造过程中产酒和生香的关键功能菌,直接影响酿酒过程,进而影响老陈醋的出品率和风味[1]。本实验从山西水塔老陈醋大曲(简称大曲)中筛选出21株酵母菌,通过对其26S rDNA D1/D2测序进行菌株鉴定并分别发酵糯米糖化液,采用静态顶空-气质联用法分析各菌株发酵产乙醇和产乙酸乙酯的含量,确定各菌株的发酵产乙醇和产乙酸乙酯的能力。为进一步优化老陈醋大曲提供数据支持。

1　材料和方法

1.1材料和仪器

大曲由水塔醋业股份有限公司提供;酵母膏、蛋白胨、琼脂粉、葡萄糖购自北京奥博星生物技术有限责任公司;糯米购自市场;α-高温淀粉酶、糖化酶购自四川省山野生物科技有限公司;氯化钠分析纯,购自天津市光复科技发展有限公司;Dream Taq Green PCR Master Mix购自Fermentas;Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR购自宝生物工程有限公司;富集培养基酵母粉1%,葡萄糖2%,蛋白胨2%,调pH至4.5培养基灭菌后再加入链霉素(终浓度30 μg/mL)、青霉素(终浓度为50 μg/mL),孟加拉红0.033 mg/mL;YPD固体培养基2%酵母膏、1%蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂粉;YPD液体培养基2%酵母膏、1%蛋白胨、2%葡萄糖。

电子天平梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;全自动高压蒸汽灭菌锅上海博讯实业有限公司;DK-450B型电热恒温水槽上海森信实验仪器有限公司;HWS智能型恒温恒湿箱宁波江南仪器厂;HZQ-F100全温振荡培养箱太仓市豪诚实验仪器制造有限公司;分光光度计、BK-FL2荧光显微镜重庆奥特光学仪器有限责任公司;GeneAmp PCR System 2720(ABI)赛默飞世而科技(中国)有限公司;ChampGel凝胶成像分析系统北京赛智创业科技有限公司;7890A-5975C型气质联用仪(GC-MS)美国安捷伦科技有限公司;HSS 86.50型全自动顶空进样器意大利DANI公司。

1.2实验方法

1.2.1酵母菌的分离纯化将10 g曲粉加入100 mL无菌蒸馏水中,振荡(28 ℃,200 r/min)20 min。取菌悬液3 mL接种于富集培养基中,振荡(28 ℃,200 r/min)培养48 h,从中取出菌液1 mL加入9 mL无菌蒸馏水,配制成10-2菌悬液,再依次配制10-3、10-4、10-5、10-6菌悬液,取0.1 mL涂布于YPD固体平板上,28 ℃下恒温培养24 h,挑选典型酵母单菌落,传代4次后,4 ℃保存备用。

1.2.2酵母菌形态学观察将酵母菌接种于YPD固体培养基平板中,28 ℃下培养3 d,观察平板中菌落的形态,并挑起菌体制片,在显微镜下观察酵母菌的细胞形态。

1.2.3酵母菌基因组DNA的制备按说明书(Instruction of Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR)方法分别制备21株酵母菌基因组DNA作为26S D1/D2扩增模板。

1.2.4PCR扩增rDNA 26S D1/D2正向引物NL-1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′),反向引物NL-4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)。反应体系(50 μL)为:模版5 μL(50 μg),引物各2 μL(20 pmol/μL),Taq DNA聚合酶Mix 25 μL,去离子水16 μL。

扩增程序:95 ℃变性5 min;95 ℃、1 min,55 ℃、1 min,72 ℃、2 min,共35个循环;72 ℃、10 min。对扩增产物进行测序。将rDNA测序结果输入数据库http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/,通过BLAST程序与数据库中的序列进行比对分析。

1.2.5种子液制备将保存的菌种划线转接YPD固体培养基中,28 ℃培养2～3 d,重复划线和培养三次以活化菌种。菌种活化后转接于YPD液体培养基中,振荡培养(28 ℃,200 r/min)1 d,得到种子液。

1.2.6糯米糖化液的制备和接种发酵预煮:称取糯米1000 g,加水(料水比1∶3.4)搅拌均匀后75 ℃水浴1 h。

糊化:加750 μL耐高温α-淀粉酶(酶活20000 U/mL),搅拌均匀,95 ℃保温2 h。

糖化:待灭菌锅自然降温至90 ℃以下,取出糊化液冷却至62 ℃,加入糖化酶2 mL(酶活100000 U/mL),62 ℃保温1 h。

酒精发酵:按照每100 mL发酵液加入1 mL种子液。30 ℃生化培养箱中培养3 d后封口发酵7 d,得到酒精发酵液。

1.2.7酒精发酵液中乙醇和乙酸乙酯含量测定样品前处理:精确取2.00 mL酒精发酵液上层液体,置于20 mL顶空瓶中,密封压盖;

顶空条件:加热炉、取样系统和传输管操作温度分别为20、85、110 ℃;样品在炉内加热时间为20 min。选择其中2个样品做重复性测试。

气相条件:色谱柱为HP-INNOWAX(60.0 m×250 μm,0.25 μm);色谱柱初始温度40 ℃(保持3 min),以5 ℃/min的速度升至80 ℃,继之以10 ℃/min升至200 ℃(保持5 min);气化室和传输线温度分别为250 ℃和220 ℃;载气He;载气流量1.0 mL/min;分流进样(分流比100∶1)。

质谱条件:EI源;电子能量70 eV;离子源温度230 ℃;四极杆150 ℃;扫描模式Scan;扫描质量范围为30～500 u。

1.3数据分析

采用外标法对乙醇和乙酸乙酯进行定量。首先根据样品中乙醇和乙酸乙酯峰面积的大致响应范围,分别配制两种物质的系列标准溶液,然后按照样品测试的实验条件,测试各标准溶液中二者的峰面积,最后利用最小二乘法计算乙醇和乙酸乙酯的线性回归方程,结果如下:

乙醇低浓度标准溶液范围:0～9.53 g/L,回归方程:y=5606951.2x+791724.4,R2=0.998;高浓度标液范围:9.53～296.87 g/L,回归方程:y=2588367.9x+59013372.0,R2=0.992。

表1　26S D1/D2测序比对分析

乙酸乙酯低浓度标液范围:0～0.75 g/L,回归方程:y=101653279.3x-172461.2,R2=0.9997;高浓度标液范围:0.75～13.11 g/L,回归方程:y=72043695.8x+21651150.8,R2=0.9999。

2　结果与讨论

2.1酵母菌菌落和细胞形态特征

从大曲中分离得到21株优势酵母菌。依据酵母形态学特征,将菌株进行初步分类,选取其中10株具有代表性的菌株描述其菌落和细胞形态(图1)。

图1　酵母菌的菌落形态(Lane1,Lane3)和光学显微镜下的菌体形态(Lane2,Lane4,400×)Fig.1　Colony morphological phenotypes of yeasts isolated from DAQU(Lane1,Lane3)and the cellular morphology under light microscope(Lane2,Lane4,400×)

菌落m10、q28、m12、q13、m25、q34表面湿润光滑,有光泽,凸起,边缘整齐;m17和q10表面干燥,褶皱,边缘为裂片状,隆起;q7和q12表面湿润,无光泽,边缘丝状延伸,隆起。细胞以出芽方式生殖,m10和q28为圆形,m12、q13、m17和q10为椭圆形,m25和q34既有椭圆形又有圆形,q7和q12为梭形。

2.2酵母菌26S rDNA D1/D2序列分析

从大曲中分离的21株优势酵母菌26S rDNA D1/D2序列分析结果见表1。

由表1测序结果可知,21株酵母的鉴定结果为2株弗比恩酵母(Cyberlindnerafabianii)分别为m10、q28,8株扣囊复膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)分别为q6、q33、q25、m11、m26、q10、q14、m17,6株异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)分别为q3、q13、q27、q19、m15、m12,3株葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)分别为m25、q2、q34,2株东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)分别为q7、q12。q3等菌种在NCBI数据库中比对结果与异常威克汉姆酵母、异常毕赤酵母相似度均为99%,最新酵母分类学将部分异常威克汉姆酵母、异常毕赤酵母、异常汉逊酵母三种酵母归为同物异名[6]。老陈醋大曲中微生物的分离鉴定多采用生理生化结合形态观察的方法[7-8],而本研究对分离菌株进行26S rDNA D1/D2测序分析,使鉴定结果更加准确[9]。

2.3乙醇和乙酸乙酯含量

21株酵母酒精发酵液中乙醇及乙酸乙酯生成量如图2所示。

图2　静态顶空-气质法测得酒精发酵液中乙醇和乙酸乙酯含量Fig.2　The content of ethyl acetate and ethyl acetate in the fermented solution after fermentation with each of the yeasts using static headspace-GC-MS

图2显示,21株酵母均能利用糯米糖化液发酵产生乙醇,同种类酵母菌比较,多数菌株产生乙醇量较为接近,但某些种类菌株产生的乙醇量变化范围比较大。如异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)产生的乙醇量最高(q19)为46.2845 g/L,最低(m12)为22.5805 g/L,相差一倍多。不同种类酵母菌之间比较,葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)m25、q2、q34发酵产乙醇相对较多,东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)q12、q7则相对较少,差别最大(q34与q12之间)能达到三倍以上;不同种类酵母菌产生乙酸乙酯差异明显,依次为:异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)m12、m15、q13、q19、q27、q3>弗比恩酵母(Cyberlindnerafabianii)m10、q28>葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)m25、q2、q34>东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)q12、q7>扣囊复膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)m11、m17、m26、q6、q10、q14、q25、q33。异常威克汉姆酵母菌(Wickerhamomycesanomalus)m12产乙酸乙酯最多,含量为4.4415 g/L,扣囊复膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)q25产乙醇最多,含量为48.577 g/L。产生最少的则分别为扣囊复膜酵母q6(含量为0.0037 g/L)和东方伊萨酵母q12(含量为11.4555 g/L)。

从自然界中富集酵母产乙酸乙酯和乙醇的研究已有很多报道,如靳艳玲等[10]利用酿酒酵母发酵甘蔗产生乙醇量达到132.26 g/L;朱浩里等[11]以早籼稻糖化液为原料,用酿酒酵母发酵,发现乙醇得率为0.463 g/g;李锐利[12]从酿造用小曲中分离筛选得到一株高产乙酸乙酯酵母菌株产乙酸乙酯量为2.152 g/L;王涛等[13]从浓香型白酒酿造过程中筛选122株酵母,最高产乙酸乙酯的菌株为毕赤酵母产量为3.74 g/L。与本研究比较可发现分离出来的产乙醇量最高的酵母q25产乙醇的量明显低,这可能是因为酵母发酵产乙醇受到各种发酵条件和酵母种类的影响,相关研究表明,扣囊复膜酵母一方面可以直接利用淀粉发酵[14],另一方面可以和酿酒酵母协同作用在酒精发酵中发挥作用[15];酵母m12产乙酸乙酯的量要略高,获得的产酯性能优良的m12菌株可以进一步研究发酵特性,优化发酵条件,提高乙酸乙酯的产量,应用于老陈醋的生产过程。

3　结论

从山西水塔老陈醋酿造大曲中富集分离纯化出21株酵母菌,对形态学初步鉴定完全符合酵母特征,进一步分子生物学鉴定结果为2株弗比恩酵母,8株扣囊复膜酵母、6株异常威克汉姆酵母、3株葡萄牙棒孢酵母、2株东方伊萨酵母。

采用静态顶空-气质联用的方法测定21株酵母菌发酵后糯米糖化液的乙醇和乙酸乙酯含量,测定结果表明产生乙酸乙酯最多的菌株为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)m12,产量为4.4415 g/L,产生乙醇最多的是扣囊复膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)q25,产量为48.577 g/L,产生最少的则分别为扣囊复膜酵母q6(含量为0.0037 g/L)和东方伊萨酵母q12(含量为11.4555 g/L)。

本实验初步研究了从大曲中分离的21株酵母菌的产乙醇和乙酸乙酯的特性,为进一步研究、优化大曲提供了数据支持。

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Isolation and identification of yeats in Daqu for aged vinegar production and their capacity for producing ethly alcohol and ethly acetate

DONG Kai-feng1,2,AN Na1,2,LI Dong-le1,2,DENG Han-sen1,CHE Jian-tu1,2,*

(1.S&V Biological Science and Technology Co.,Ltd.,Beijing 102200,China; 2.Shanxi Shuita Vinegar Industry Co.,Ltd.,Taiyuan 030404,China)

Twenty-one yeast strains were isolated from Daqu,a starter participating in fermentation particularly for producing aged vinegar,via conventional yeast culture. The colony and cellular morphological characteristics of the yeasts were observed. The sequence analysis of 26S rDNA(D1/D2 region)from the yeasts was subsequent performed to further identify the strains. The fermentation with each of these yeasts was finally carried out,and ethyl alcohol,as well as ethyl acetate in fermented solution were detected using static headspace-GC-MS for investigation of their function. The results showed that the isolated yeast strains contained 2Cyberlindnerafabianii,8Saccharomycopsisfibuligera,6Wickerhamomycesanomalus,3Clavisporalusitand 2Issatchenkiaorientalisstrains. All isolated yeast strains had capacity to produce ethyl alcohol,but the concentrations were different between the strains. Ethyl acetate was also produced,which concentration was various in different strains. The highest levels of ethyl acetate and ethyl alcohol produced byWickerhamomycesanomalusm12 andaccharomycopsisfibuligeraq25 reached 4.4415 g/L and 48.4577 g/L respectively in fermented liquor,while the lowest levels bySaccharomycopsisfibuligeraq6 andIssatchenkiaorientalisq12 were 0.0037 g/L and 11.4555 g/L. These data indicated that the contribution of the yeast strains in Daqu on producing ethyl alcohol and ethyl acetate for aged vinegar might be different.

Daqu(used for aged vinegar production only);yeast;static headspace gas chromatographymass spectrometry;ethyl ethanol;ethyl acetate

2015-10-19

董凯锋(1984-)，男，硕士研究生，主要从事发酵食品原理与技术方面的研究，E-mail：dongfeng2005485@163.com。

车建途(1952-)，男，博士，教授，主要从事分子微生物以及药理学方面的研究，E-mail：chejiantu@126.com。

TS201.3

A

1002-0306(2016)10-0213-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.035