张嫱，叶明（1.北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏银川750021；2.合肥工业大学生物与食品学院，安徽合肥230009）

拟青霉发酵生产胞外多糖的研究

张嫱1，2，叶明2，*
（1.北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏银川750021；2.合肥工业大学生物与食品学院，安徽合肥230009）

探讨拟青霉属产胞外多糖和菌丝体生物量最大时的液体培养条件的优化，主要考察培养基组分、碳氮比和物理参数这三方面的影响。结果表明，最适培养基配方为葡萄糖30 g/L、酵母膏20 g/L、KH2PO40.5 g/L，MgSO40.1 g/L。最适培养条件为27℃，摇床转速400r/min，培养时间为7d。在此条件下，拟青霉属胞外多糖的产量为2.51g/L，菌丝体生物量为23.5g/L。

拟青霉属；胞外多糖；菌丝体生物量

近年来，许多从蘑菇分离得到的天然多糖和多糖蛋白复合物已被用于药物治疗。研究证明，担子菌类蘑菇多糖具有很强的药效，如预防肿瘤、直接抵抗肿瘤、与化学药物协同抗击肿瘤及对肿瘤转移有抑制作用［1-2］。

拟青霉菌，是一类子囊菌昆虫病原真菌，据报道有很多的生物活性，如抗肿瘤，抗免疫过敏和抗氧化活性［3-4］。天然子实体的产量是有限的，采用人工培育子实体已被证明难以实现。然而，采用最佳的液体培养条件，在发酵罐内的菌丝体和生物活性分子可以显著增加，同时缩短了发酵时间及受污染程度。大量研究表明，可以通过微生物液体培养，使其代谢产生胞内或胞外生物活性成分，这可应用于保健食品［5］。目前基于菌体次生代谢产物的液体培养条件优化已有大量研究，但关于拟青霉菌的液体培养近几年才有所报道。

菌体生长所需的营养物质，如碳和氮，在细胞增殖和代谢生物合成中有重要作用，培养基质中组分对于任何发酵物质的产量都很重要。因此，如果可以克服拟青霉菌在液体培养基内的拮抗性，培养的菌丝体和其代谢产生的活性物质就可应用于食品加工［6］。因此，本文的目的就是基于菌丝体生物量和胞外多糖的量，优化拟青霉菌液体培养基和培养条件，以期为开发出安全、高效的拟青霉菌多糖保健品提供理论依据和技术指导。

1　材料与方法

1.1材料

拟青霉菌菌株：分离并保存于北方民族大学生物科学与工程学院微生物资源实验室。

1.2微生物和液体培养

菌丝生长的培养基为YMP：10.0g/L葡萄糖、10.0g/L酵母膏、15.0 g/L麦芽提取物、10.0 g/L蛋白胨。

5L发酵罐内菌丝体生长的培养基：30.0g/L葡萄糖、20 g/L酵母膏、0.5g/L KH2PO4、0.1 g/L CuCl2·2H2O。

种子液制备：250 mL摇瓶中装入含有8 mL活性原液的50 mL YMP培养基，培养3d。对于菌丝体的增长，菌丝体用高速搅拌机混合均匀，2%的种子培养基注入50 mLYMK基质，置于摇床培养8 d（27℃，200 r/min）后，然后在5L发酵罐内发酵。接种量为2%（体积比）。为了考察各参数对胞外多糖的影响，通风比从0.5 vvm增加至1.5vvm，搅拌速度从100r/min变化至500r/min。

1.3菌丝体生物量和胞外多糖的测定

培养结束后，不同发酵条件下的发酵液于5 000 r/min离心20min。菌丝体水洗3次，50℃低温烘干。发酵液透析后，用3倍体积乙醇沉淀，4℃静置过夜，0.45 mm滤纸过滤，沉淀于60℃干燥至恒重。胞外多糖的计算采用苯酚-硫酸法［7］。

1.4统计分析

在本试验中所有数据均平行3次，结果为平均值±标准偏差。

2　结果与讨论

2.1温度和初始pH的影响

为了研究温度对菌丝体生长和胞外多糖（EPS）产生的影响，在拟青霉菌培养过程中改变不同的温度（15℃～33℃），其它条件不变，发酵后测定多糖及生物量，结果见图1。

图1　温度对拟青霉菌菌丝体和胞外多糖产量的影响Fig.1　The effect of temperature on mycelium growth and EPS production

如图1所示，基于拟亲霉胞外多糖产率选取最佳的培养温度，EPS产生的最适培养温度为27℃。此时，菌丝体生物量虽然不是最大，但对于拟青霉发酵产生的胞外多糖，在27℃时更有利于代谢产生。故选取27℃作为发酵温度。

在培养环境中，培养pH对细胞形态学和代谢物合成有显著影响。本试验中，改变初始pH4.0～11.0，结果如图2所示。

图2　初始pH对菌丝体和胞外多糖产量的影响Fig.2　The effect of pH on mycelium growth and EPS production

如图2所示，在弱酸或中性环境（pH 5.0～8.0）下，能够产生较多的菌丝体和EPS，其在中性pH条件下，更适宜液体培养基中细胞的生长和EPS的产生，而且菌丝体会产生有机酸，这会降低中性pH至适宜培养条件。

2.2碳源和氮源的影响

担子菌的液体培养过程中，不同的碳源会影响菌丝体的生长及其代谢产物。为了找到拟青霉菌的菌丝体生长和EPS产生的适宜碳源，1.0%（g/mL）的不同碳源在无糖培养基中培养4 d。结果如图3所示。

图3　碳源对拟青霉菌菌丝体和胞外多糖产量的影响Fig.3　The effect of different carbon source on mycelium growth and EPS production

研究发现，与无糖培养基相比，含有碳源的培养基利于菌丝体生长。在含有各种碳源的培养基中，葡萄糖做碳源的培养基产生EPS最多，其次是淀粉（图3）。因此，葡萄糖被作为主要的碳源，这是由于其价格低廉、易于工业化。

氮源对菌丝体生长和多糖产生也有重要影响。为了研究氮源对拟青霉菌的菌丝体生长和EPS产生的影响，0.5%的无机氮源和有机氮源分别加至无氮培养基。在本试验中，选取8种氮源，结果如图4所示。

图4　氮源对拟青霉菌菌丝体和胞外多糖产量的影响Fig.4　The effect of different nitrogen source on mycelium growth and EPS production

如图4所示，添加酵母膏的培养基产生的菌丝体最多（7.10 g/mL），EPS含量最高（0.46 g/mL），同时含有机氮源的培养基中的菌丝体产量明显高于无机氮源的，主要是有机氮源不仅含有蛋白质和氨基酸，而且含有其它生长因子等，有利于菌丝体的生长及代谢产物的产生。

2.3碳氮比的影响

为了研究碳氮比对拟青霉菌丝体生长和EPS生产的影响，改变葡萄糖浓度：10 g/L～60 g/L，固定酵母膏浓度，即改变不同的碳氮比（1∶1～6∶1），结果见表1。

如表1所示，碳氮比为1∶1～5∶1时适宜菌丝体生长和EPS产生，当碳氮比为2∶1时，菌丝体和EPS产量最高。葡萄糖浓度较高时，供菌丝体生长和EPS产生的底物减少。

表1　碳氮比对菌丝体生物量和多糖的影响Table 1　Effects of C/N Ratio on mycelia biomass and EPS production by Paecilomyces japonica

2.4微量元素的影响

为了研究矿物质和微量元素对菌丝体生长和EPS产生的影响，在培养基中添加1.0g/mL矿物质和0.1g/mL的微量元素。对照组为仅含有10 g/mL葡萄糖、5 g/L酵母膏、不含有矿物质和微量元素。添加0.5 g/mL KH2PO4，以适宜拟青霉菌丝体的生长和EPS的产生。报道称PO43-参与多糖的生物合成，低浓度的矿物元素对生长效应和EPS产生有重要影响。铁离子是亚铁红素辅酶，参与电子转移反应。锰离子是超氧化物歧化酶的辅酶，而且对酶催化反应很重要，尤其是针对应用于ATP和合成DNA、RNA的酶。在真菌的液体培养基中，添加不同矿物质可以促进菌丝体的生长和EPS产生。本试验添加了0.1 g/mL CuCl2·2H2O，促进了拟青霉菌EPS的产生。其结果如表2所示。

表2　微量元素对菌丝体生物量和多糖的影响Table 2　Effects of trace element on mycelia biomass and EPS production by Paecilomyces japonica

如表2所示，最佳组合为K2HPO4和MgSO4，这一结果与Ca2+的积累通过酶的作用抑制真菌的生物代谢物的合成理论一致。

2.5搅拌作用对菌丝体生长和EPS产生的影响

搅拌强弱对底物、加热和溶解氧（DO）转移都有重要影响。搅动会产生剪切力，这会引起菌丝体形态学变化，溶解氧和剪切力对多糖产生有重要影响。本试验通过改变摇床搅拌速度，其它条件不变，测定发酵液中的多糖产率及菌丝体生物量，结果见表3。

表3　搅拌作用对菌丝体生物量和多糖的影响Table 3　Effects of agitation on mycelia biomass and EPS production by Paecilomyces japonica

由表3可见，当搅拌速度最大时，葡萄糖消耗水平较高。当搅拌速度为100 r/min时，由于相对传质较慢，残余葡萄糖消耗缓慢。当搅拌速度为400 r/min时，菌丝体含量最多（23.1 g/mL），EPS产量最高（2.51 g/mL）。关于拟青霉菌的搅拌促成的细胞形态学和EPS，在低搅拌速度时可形成一簇菌丝体。当搅拌速度较大，通风好，底物浓度合适时，与自由菌丝体相比，菌丝体主要呈球状。而且，拟青霉菌的球形菌丝体会影响EPS的产生。

2.6通风对菌丝体生长和EPS产生的影响

通风辅助次级代谢产物中底物、产物和氧的传质。因此，通风强度是影响EPS产生的一项重要因素。在本研究中，其它发酵条件不变，只改变发酵时的通风状况，测定发酵后的多糖产率及菌丝体生物量，结果如表4。

表4　通风对菌丝体生物量和多糖的影响Table 4　Effects of aeration on mycelia biomass and EPS production by Paecilomyces japonica

如表4可知，当通风1.0 vvm时，菌丝体数量达到最大（23.5 g/mL），EPS也达到最高（2.51 g/mL）。对于液体培养基中多种担子菌产生EPS，前人也报道过类似结果［8-9］。

3　结论

综上所述，为了得到最多的拟青霉菌EPS和菌丝体，本文研究了液体培养基的最优培养条件和基质组分。通过试验确定，最优培养基为30 g/mL葡萄糖，20 g/mL酵母膏，0.5 g/mL KH2PO4和0.1 g/mL MgSO4· 7H2O。最适培养条件为温度27℃、转速400 r/min和通风1.0 vvm，初始pH不受限制。采用最优培养条件和调整后的培养介质，5 L生物反应器内发酵培养，菌丝体生长最大可达23.5 g/mL，EPS最高可到2.51 g/mL。

［1］ Novak M，Vetvicka V.β-glucans，history，and the present：immunomodulatory aspects and mechanisms of action［J］.Journal of immunotoxicology，2008，5（1）：47-57

［2］Lee J S，Hong E K.Hericium erinaceus enhances doxorubicin-induced apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells［J］.Cancer letters，2010，297（2）：144-154

［3］Shin K H，Lim S S，Lee S H，et al.Antioxidant and immunostimulating activities of the fruiting bodies of Paecilomyces japonica，a new type of Cordyceps sp［J］.Annals of the New York Academy of Sciences，2001，928（1）：261-273

［4］Shin K H，Lim S，Lee S，et al.Anti‐tumour and immuno‐stimulating activities of the fruiting bodies of Paecilomyces japonica，a new type of Cordyceps spp［J］.Phytotherapy Research，2003，17（7）：830-833

［5］ Reis L，Ritter C E T，Fontana R C，et al.STATISTICAL OPTIMIZATION OF MINERAL SALT AND UREA CONCENTRATION FOR CELLULASE AND XYLANASE PRODUCTION BY Penicillium echinulatum IN SUBMERGED FERMENTATION［J］.Brazilian Journal of Chemical Engineering，2015，32（1）：13-22

［6］韦朝阳，贺亮，李卫旗，等.不同中药水提物对蝉拟青霉液体深层发酵和产物活性的影响［J］.食品工业科技，2015，36（3）：168-171

［7］鲁晓岩.硫酸-苯酚法测定北冬虫夏草多糖含量［J］.食品工业科技，2002，23（4）：69-70

［8］Lawford H，Rousseau J.Effect of oxygen on the rate of β-1，3-glucan microbial exopolysaccharide production［J］.Biotechnology letters，1989，11（2）：125-130

［9］Kim S W，Hwang H J，Xu C P，et al.Effect of aeration and agitation on the production of mycelial biomass and exopolysaccharides in an enthomopathogenic fungus Paecilomyces sinclairii［J］.Letters in applied microbiology，2003，36（5）：321-326

Research on Fermentation of Exo-polysaccharides from Paecilomyces japonica

ZHANG Qiang1，2，YE Ming2，*
（1.Life Sciences&Engineering College，Beifang University of Nationalities，Yinchuan 750021，Ningxia，China；2.College of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，Anhui，China）

The liquid culture conditions were optimized for maximal production of mycelial biomass and exopolysaccharide by Paecilomyces japonica.The effects of medium composition，C/N ratio and physical parameters were investigated.From these experiments，30 g/L glucose，20 g/L yeast extract，0.5 g/L KH2PO4，and 0.1 g/L MgSO4in distilled water were found to be the most suitable carbon，nitrogen，and mineral sources，respectively. The optimal temperature，initial pH，agitation，and aeration were determined to be 27℃，uncontrolled pH，400 r/min and for 7d，respectively.Under these optimal conditions，the maximum mycelial growth and polysaccharides production were 2.51 g/L and 23.5 g/L，respectively.

Paecilomycesjaponica；exo-polysaccharide；mycelialgrowth

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.033

张嫱（1980—），女（汉），讲师，博士，研究方向：天然产物结构与功效研究。

2015-08-26