年贺凤，朱桂花，韦萌萌，马帅，黄梅（北方民族大学化学与化学工程学院，宁夏银川750021）

葡萄籽蛋白脱色试验研究

年贺凤，朱桂花*，韦萌萌，马帅，黄梅
（北方民族大学化学与化学工程学院，宁夏银川750021）

以宁夏葡萄籽为原料，采用碱溶酸沉淀法提取的葡萄籽粗蛋白呈紫褐色，对其脱色方法进行研究。通过比较活性炭及双氧水的脱色效果，确定了以双氧水为脱色剂的试验方法。结果表明，脱色时白度和产率的控制条件相互制约，需综合考虑实际需求选择脱色条件。经过正交试验优化并综合考虑白度和产率两项指标，当固液比为1∶25（g/mL）时，确定pH8.0、双氧水用量15 mL、脱色温度55℃、脱色时间40 min为最适脱色条件，该条件下脱色蛋白产率为78.21%，白度为14.71。

葡萄籽；蛋白；脱色；白度

我国是葡萄生产大国，每年的产量约有500多万t，葡萄酿酒、果汁加工过程中产生的下脚料主要是葡萄皮和葡萄籽，其中葡萄籽约占鲜果的4%～7%产量可观。目前，曾经作为废弃物的葡萄籽受到广泛关注，葡萄籽油、葡萄籽原花青素的提取和应用已逐步实现产业化，市场上相关的高附加值产品层出不穷。葡萄籽榨油后的饼粕及提取原花青素后剩余物中含有12%～16%蛋白，其中包含谷氧酸、甘氨酸、丙氨酸等18种氨基酸，人体必需的8种氨基酸俱全，而撷氨酸、精氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸含量都相当于大豆蛋白中的含量，是优质的蛋白质资源，极具开发潜力［1-2］。葡萄籽及其饼粕中的蛋白主要作为动物饲料得以简单利用，且相关研究主要集中在蛋白的提取方面［3-5］，相信随着对葡萄籽蛋白研究的不断深入，这种优质的蛋白资源将在食品、保健、特种饲料等方面大有作为，市场潜力巨大。

葡萄籽中含有大量色素，通过预处理后提取出的粗蛋白呈现褐色，有必要进行脱色以利于进一步的开发和利用。目前，实验室中对植物蛋白脱色常用的方法包括有机溶剂脱色法、活性炭脱色法、双氧水脱色法［6］。有机溶剂脱色法是利用蛋白质及脂类等杂质在溶剂中的溶解度不同实现脱色，肖海峻［7］等以无水乙醇为浸提剂对苜蓿叶蛋白脱色脱腥工艺参数进行了研究，但需要3级浸提才有理想的效果，过程较繁琐。活性炭表面的微孔结构使其对多数有机物质具有较强的吸附能力，陆晨［8］研究了活性炭对茶渣中蛋白的脱色性能，脱色率达90%时蛋白质损失率超过60%，说明活性炭对茶渣蛋白有较强的吸附作用。双氧水是一种无色透明的液体氧化剂，可使植物粗蛋白中的有色物质氧化分解，脱色效果明显而且自身无残留，安全性较高。罗仓学［9］比较了次氯酸钠、亚硫酸钠、双氧水3种不同的脱色剂对甘薯糖蛋白粗提物的脱色效果，表明双氧水的脱色性能更优。葡萄籽蛋白的脱色研究鲜有报道，本研究从实际应用及安全性出发，比较了活性炭与双氧水对葡萄籽粗蛋白的脱色效果，通过单因素及正交试验优化了脱色试验条件，为葡萄籽蛋白的开发利用提供参考。

1　材料与方法

1.1材料

葡萄籽：宁夏红酿酒厂；氢氧化钠、浓盐酸、石油醚、浓硫酸、硼酸、邻苯二甲酸氢钾、硫酸铜、硫酸钾、甲基红-溴甲酚氯指示剂：均为分析纯试剂。粉末状活性炭（200目～300目）、30%双氧水：工业食品级。

1.2仪器设备

KA-1000离心机：上海安亭科学仪器厂；78-1磁力加热搅拌器：常州国华电器有限公司；PHS-3C精密pH计：上海精密科学仪器有限公司；FA-1004N型电子天平：上海光正医疗仪器有限公司；SF-130型高速中药粉碎机：长沙市岳麓区中南制药机械厂；101FAB-3型电热鼓风干燥箱：上海电光仪器仪表有限公司；WSB-1白度仪：上海昕瑞仪器仪表有限公司；半微量凯式定氮仪：上海洪纪仪器设备有限公司。

1.3方法

1.3.1葡萄籽粗蛋白的提取

葡萄籽粉碎并过60目筛，用石油醚以1∶2（g/mL）的料液比浸泡24 h进行脱脂。脱脂葡萄籽粉与0.10 mol/L NaOH溶液以1∶25（g/mL）的料液比混合，于40℃水浴搅拌加热30 min，冷却至室温离心分离，取上清液加入4 mol/L HCl溶液等电点沉淀。抽滤，取滤渣，置于50℃烘箱中5 h。干燥后研钵粉碎，得葡萄籽蛋白粗品，以脱脂葡萄籽为基准计算产率，测定蛋白含量。

1.3.2蛋白含量测定

采用GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法测定葡萄籽蛋白含量。

1.3.3葡萄籽粗蛋白脱色效果检测

葡萄籽粗蛋白及脱色蛋白经干燥、研磨后测定白度。

1.3.4活性炭及双氧水脱色效果比较试验

1.3.4.1活性炭脱色

向三角瓶中加入4.00 g葡萄籽粗蛋白及0.10 mol/L NaOH溶液，料液比为1∶25（g/mL），混合搅拌使蛋白质溶解，加入活性炭粉末置于水浴中搅拌加热30 min，趁热抽滤，滤液冷却至室温后滴加4 mol/L HCl溶液至等电点，抽滤后的滤渣置于50℃烘箱中干燥5 h，研钵粉碎得脱色葡萄籽蛋白，以粗蛋白为基准计算产率，测定白度及蛋白含量。

1.3.4.2双氧水脱色

向三角瓶中加入4.00g葡萄籽粗蛋白及0.10mol/L NaOH溶液，料液比为1∶25（g/mL），混合搅拌使蛋白质溶解，加入双氧水置于水浴中搅拌加热进行脱色，溶液冷却至室温后滴加4 mol/L HCl溶液至等电点，抽滤后的滤渣置于50℃烘箱中干燥5 h，研钵粉碎得脱色葡萄籽蛋白，以粗蛋白为基准计算产率，测定白度及蛋白含量。

1.3.5萄籽粗蛋白脱色单因素试验

以溶液pH、脱色剂用量、脱色时间、脱色温度为考察因素，以脱色后葡萄籽蛋白的白度及蛋白产率为衡量标准，确定各单因素对脱色效果的影响规律。

1.3.5.1溶液pH的影响

在双氧水用量为20 mL、脱色温度65℃、脱色时间40 min的条件下，溶液pH分别为7.5、8.0、8.5、9.0、9.5时进行单因素试验，根据脱色后蛋白白度及产率确定较优的pH。

1.3.5.2脱色剂用量的影响

在pH为8.0、脱色温度65℃、脱色时间40 min的条件下，双氧水用量分别为5、10、20、30、40、50、60 mL时进行单因素试验，根据脱色后蛋白白度及产率确定较优的脱色剂用量。

1.3.5.3脱色温度的影响

在pH为8.0、双氧水用量为20 mL、脱色时间为40 min的条件下，脱色温度分别为40、50、60、70、80℃时进行单因素试验，根据脱色后蛋白白度及产率确定较优的脱色时间。

1.3.5.4脱色时间的影响

在pH为8.0、双氧水用量为20 mL、反应温度50℃的条件下，脱色时间分别为20、30、40、50、60 min时进行单因素试验，根据脱色后蛋白白度及产率确定较优的脱色时间。

1.3.6正交试验

优化脱色条件，在单因素试验的基础上，通过L9（34）正交试验应进一步优化试验条件，设计的因素水平见表1。

表1　 正交试验因素及水平表Table 1　The factors and levels of the orthogonal test

1.3.7验证试验

在正交试验所确定的最优脱色条件下进行5次平行试验，以验证脱色方法的稳定性及可靠性。

2　结果与分析

2.1活性炭及双氧水脱色效果的比较

本试验采用碱溶酸沉法提取的脱脂葡萄籽粗蛋白呈紫褐色，粗蛋白产率48.06%，白度为3.07，凯氏定氮法测定蛋白含量为50.47%。活性炭及双氧水因脱色后无残留而具有较高的安全性，但二者的脱色原理不同。活性炭比表面积大，通过物理吸附进行脱色，其来源广、价格低，对有色物质的吸附能力在酸性溶液较强［10-11］，但吸附选择性不高。H2O2是强氧化剂，通过对色素分子中的生色基的共轭双键能产生破坏作用而脱色，自身易分解为水和氧气，对环境及样品无污染，其氧化能力在碱性条件下更强但稳定性较差。本试验采用工业食品级活性炭及双氧水分别进行脱色试验，结果（见表2）表明：活性炭对葡萄籽粗蛋白吸附性强，脱色的选择性较差，不适合做脱色剂；双氧水脱色效果相对较好，由于葡萄籽蛋白只能在碱性条件下溶解后才可进行脱色，双氧水氧化性增强稳定性降低，表现出使用量较大且对蛋白有一定的破坏作用，因此需进一步优化脱色条件。

表2　活性炭及双氧水脱色试验结果比较Table 2　The result of activated carbon and hydrogen peroxide decolorizing test

2.2不同单因素对脱色效果的影响

2.2.1pH的影响

pH对脱色蛋白产率及白度的影响结果见图1。

图1　pH对葡萄籽粗蛋白脱色效果的影响Fig.1　Effect of pH on decolorization efficiency of grape seed crude protein

结果表明，随着pH的增大，蛋白产率呈下降趋势，白度则先增大后降低，pH为8.0时白度最大。双氧水氧化能力随溶液碱性增大而提高，导致对蛋白的破坏作用随pH的升高而增强，使蛋白产率随之下降，pH大于8.5时蛋白产率下降尤其明显。白度的变化则说明pH在一定范围内双氧水以破坏色素为主，但碱性过强导致以蛋白的氧化破坏作用为主而产生较多有色产物，从而使白度降低。综合考虑白度和产率的变化情况，溶液的pH应控制在8.0附近。

2.2.2脱色剂用量的影响

脱色剂用量对脱色蛋白产率及白度的影响结果见图2。

结果表明，随着双氧水用量的增加，蛋白产率呈下降趋势，白度则先增大后降低，说明双氧水在脱色时对蛋白也造成了破坏。双氧水用量在10 mL至20 mL之间时蛋白产率变化不大，之后下降明显。双氧水用量在10 mL至40 mL之间时白度的增加缓慢，用量为40 mL时白度最大。综合考虑白度和产率的变化情况，双氧水用量控制在20 mL左右较为合适。

图2　脱色剂用量对脱色蛋白产率及白度的影响Fig.2　Effect of amounts of decolorizing agents on decolorization efficiency of grape seed crude protein

2.2.3脱色温度的影响

脱色温度对脱色蛋白产率及白度的影响结果见图3。

图3　温度对葡萄籽蛋白脱色效果的影响Fig.3　Effect of different temperature on decolorization efficiency of grape seed crude protein

由图3可知，随着脱色温度的升高，脱色蛋白的白度提高而产率下降。试验发现，脱色温度达80℃时溶液稠度明显增加，而脱色温度高于60℃时蛋白产率下降尤为明显，说明温度的升高在促进脱色的同时对蛋白的破坏作用也在增强。综合考虑白度和产率的变化情况，脱色温度应控制在50℃～60℃的范围内。

2.2.4脱色时间的影响

脱色时间对脱色蛋白产率及白度的影响结果见图4。

图4　脱色时间葡萄籽蛋白脱色效果的影响Fig.4　Effect of different time on decolorization efficiency of grape seed crude protein

结果表明，随着反应时间的增加，葡萄籽蛋白的脱色效果逐渐增加，白度提高，脱色蛋白产率下降。脱色时间40 min以后，随时间的增加白度急剧增加的同时蛋白产率亦急剧下降，说明达到一定脱色时间时，双氧水脱色及对蛋白的破坏作用几乎同时加强，因此在应用时可根据具体需求控制脱色时间。本试验综合考虑白度和产率的变化趋势，控制脱色时间在30 min～40 min可获得较为稳定的产率和白度。

2.3正交试验结果

通过单因素试验发现，脱色葡萄籽蛋白的白度与其产率基本成反比关系，但各因素对二者的影响规律又有差异，说明单因素之间存在着相互影响，为了进一步优化脱色条件，根据单因素试验结果设计了L9（34）正交试验（见表1），试验结果见表3。

白

度

表3　葡萄籽蛋白脱色正交试验结果Table 3　Result of decolorization of grape seed crude protein orthogonal test

由表3可知，在正交试验的条件下，各因素对葡萄籽蛋白脱色产率的影响主次为A＞B＞D＞C，最佳组合为A2B1C3D2；对脱色蛋白白度的影响主次为B＞C＞D＞A，最佳组合为A3B3C2D3。从各因素极差的相对大小可以看出：脱色时溶液pH及双氧水用量对产率影响较大，脱色温度及脱色时间影响较小；脱色时双氧水用量对白度影响较大，pH影响较小。从二者最佳组合的组成来看，脱色条件较温和时产率较高，脱色条件剧烈时白度较高，说明采用双氧水对葡萄籽蛋白进行脱色时白度和产率的控制条件相互制约，需综合考虑实际需求选择脱色条件。本试验综合考虑白度和产率两相指标，选择正交试验的第4组方案（A2B1C2D3）为较佳的组合，即pH为8.0、双氧水用量为15 mL、脱色温度为55℃、脱色时间为40 min，此条件下脱色蛋白产率为78.21%，白度为14.71。

2.4验证试验

在5个三角瓶中分别称取4.00 g葡萄籽粗蛋白，0.10 mol/L的NaOH溶液，料液比为1∶25（g/mL），混合搅拌使蛋白质溶解后加入15 mL双氧水，将溶液pH调整到8.0，料液比为1∶25（g/mL）置于水浴中55℃搅拌加热40 min，5次平行试验结果见表4。

表4　 验证试验及结果Table 4　Validation test and the result

结果表明，用双氧水对葡萄籽粗蛋白进行脱色的蛋白产率及白度平均值分别为77.88%和14.98，变异系数分别为0.51%和1.7%，试验数据具有较好的重现性，说明该方法稳定可靠。

2.5结论

采用碱溶酸沉法提取的葡萄籽粗蛋白呈紫褐色白度为3.07，蛋白含量为50.47%。通过工业食品级活性炭及双氧水的脱色比较试验发现，双氧水脱色效果相对较好，且条件温和、操作简单、对环境无污染，可作为葡萄籽粗蛋白脱色的参考方法。试验表明，脱色时白度和产率的控制条件相互制约，脱色条件较温和时产率高白度低，脱色条件剧烈时白度较高而产率较低，需综合考虑实际需求选择脱色条件。经过正交试验优化并综合考虑白度和产率两项指标，本试验选择pH8.0、双氧水用量15 mL、脱色温度55℃、脱色时间40 min为最适脱色条件，该条件下脱色蛋白产率为78.21%，白度为14.71。

［1］邹磊.酿酒后葡萄籽综合利用的研究进展［J］.中国酿造，2012，31 （1）：16-18

［2］廖德胜，王敬勉，王章莉，等，葡萄籽油和饼粕的化学成分及特性研究［J］.武汉植物学研究，1991，9（2）：181-184

［3］李凤英，崔蕊静，李春华，等.葡萄籽蛋白的提取工艺研究［J］.中国油脂，2005，30（4）：50-54

［4］赵毅敏.葡萄籽蛋白提取工艺研究［J］.河南科学，2009，27（5）：1230-1232

［5］夏辉，丁丹华，万辉，等.葡萄籽蛋白提取工艺的研究［J］.油脂工程·技术，2010，37（8）：37-39

［6］袁道强，梁丽琴，王振锋，等.改性植物蛋白的研究及应用［J］.食品研究与开发，2005，26（6）：13-15

［7］肖海峻，孟利前，杨新建，等.苜蓿叶蛋白脱色脱腥最佳工艺参数的研究［J］.食品研究与开发，2013，34（14）：69-72

［8］陆晨.茶渣中蛋白提取、脱色及改性的研究［D］.无锡：江南大学，2012：1-52

［9］罗仓学，钱鑫.甘薯糖蛋白脱色工艺研究［J］.食品工业科技，2009，30（9）：214-216

［10］王运生，李志伟，杨秀.在活性炭脱色中pH值的影响研究［J］.发酵科技通讯，2007，36（3）：7-8

［11］车志敏，李彩红，赵国宝，等.血红蛋白脱色过程中蛋白收率的研究［J］.食品科技，2004（8）：85-88

Study on Decolorization of Grape-seed Crude Protein

NIAN He-feng，ZHU Gui-hua*，WEI Meng-meng，MA Shuai，HUANG Mei
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Beifang University of Nationalities，Yinchuan 750021，Ningxia，China）

Grape-seed crude protein which was purple brown in color was extracted from the Ningxia local grape seed used as raw material，by an alkali-solution and acid-isolation method.Herein，the decolorization of crude protein was studied.A bleaching method with H2O2as a kind of decolorant was finally selected through comparing the bleaching effects with active carbon and H2O2.The results showed that in bleaching，the conditions for whiteness and yield were restricting each other.Therefore，the bleaching conditions must be selected by comprehensively considering the actual demands.The optimum bleaching conditions were found by the singlefactor and orthogonal experiments and with the two aspects of whiteness and yield in consideration.The optimum conditions were that the solid-liquid ratio was 1∶25（g/mL），pH was 8.0，the quantity of H2O2was 15 mL，the bleaching time was 40 min，and the bleaching temperature was 55℃.The decolorized grape seed protein with a whiteness of 14.71 was produced under the optimum conditions，and the yield of the decolorized grape seed protein was 78.21%.

grapeseed；protein；decolorization；whiteness

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.004

国家级大学生创新实验项目（201411407035）

年贺凤（1993—），女（汉），本科生，制药工程专业。

朱桂花（1964—），女（汉），教授，硕士，研究方向：化学工艺。

2015-08-21