庄锡伟，黎志全（佛山市禅城区中心医院，广东528031）

精子DNA损伤与顶体酶活性及精液常规参数的相关性分析*

庄锡伟，黎志全（佛山市禅城区中心医院，广东528031）

目的探讨精子DNA损伤与顶体酶活性及精液常规参数的相关性。方法收集2013年1月至2015年4月在该院就诊的291例男性不育患者的精液，分析精子形态、密度、活动率及精液常规。采用精子染色质扩散法检测精子DNA损伤，分析其与顶体酶及精液常规参数的关系。结果精子DNA碎片指数与患者年龄、精液体积及精液液化时间无关，而与顶体酶活性及A+B级精子百分率呈负相关［相关系数（r）=-0.352、-0.305，P＜0.01］，与精子头部畸形及D级精子百分率呈正相关（r=0.157、0.284，P＜0.01）。结论精子质量评价指标可以包括独立的精子DNA损伤，也可以结合其他精子评价指标，为男性不育的辅助生殖技术及诊断提供理论依据。

DNA；精液/化学；顶体蛋白酶；精子计数；精子能动性；精子头；不育，男（雄）性；精子DNA碎片指数

多种疾病或多种因素均会造成男性不育。世界卫生组织将男性不育病因分为性交或射精障碍、输精管梗阻、精索静脉曲张、免疫性不育、内分泌异常、生殖道感染、染色体异常等［1］。有报道称，精子DNA损伤会引起体外受精中的精子受精能力和胚胎发育潜能下降，导致临床妊娠率降低和流产率增高［2］。因此，精子DNA损伤被认为是一项新的评价精子质量的检测指标［3］。有研究显示，男性年龄［4］、吸烟［5-6］、精索静脉曲张［7-9］、胰岛素依赖型糖尿病及体质量指数与精子DNA损伤呈正相关［10-11］。本研究拟采用精子染色质扩散法检测精子DNA损伤，分析其与顶体酶及精液常规参数的关系。

1　资料与方法

1.1研究对象选取2013年1月至2015年4月就诊于本院的291例男性不育患者作为研究对象，平均年龄（34.2±6.5）岁。所有入选对象具有完整的按照世界卫生组织精液分析手册中精液分析项目（包括精子形态、活动率、密度、活力等）检测结果，精子DNA损伤采用第1次检测结果。

1.2方法

1.2.1精液检查患者禁欲3～7 d，手淫方法取精。采用严格形态学评价标准进行精子形态分析。采用WLJY-9000型精子分析系统（北京伟力公司）检测精子活动率［A级精子曲线速率（curvilinearvelocity，VCL）≥35 μm/s，B级精子VCL 15～＜35 μm/s，C级精子VCL 10～＜15 μm/s，D级精子VCL＜10 μm/s］。按照《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》第5版［1］进行精液常规检查，分别测定精子密度、pH值、精液体积等。

1.2.2精子DNA损伤检测采用精子Halosperm试剂盒（西班牙Halotech公司）检测精子DNA损伤，严格按照试剂盒说明书操作。其原理是将精子悬液与低熔点琼脂糖混合并铺于载玻片上，经过酸处理去除核蛋白，保留精子DNA部分，然后进行瑞-吉染色。正常精子染色质结构松散，DNA环附着于残留的精子核，瑞-吉染色形成特征性晕环；DNA损伤的精子则不产生或产生很小的晕环。根据晕环有无及大小判断精子DNA是否有碎片，评估精子DNA完整性，根据光晕与精子头部横径比例，以精子头直径小于或等于1/4为小光晕作为判断标准，计算精子DNA碎片指数（DNA fragmentationindex，DFI），即小光晕和无光晕精子占计数精子总数的百分率。按DFI大小分为四组，即DFI＜10%、10%～20%、＞20%～30%、＞30%。

1.2.3顶体酶活性测定采用深圳华康生物医学工程有限公司顶体酶试剂盒，严格按照说明书进行操作。精子顶体酶包括约50多种水解酶，其中精氨酸酰胺酶活性可反映顶体酶全部活性，采用改良Kennedy法检测。精子顶体酶活性的参考区间为48.2～218.7 μU/106精子。

1.3统计学处理应用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，各组均数比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法检验，方差不齐时用Dunnert法；采用两变量相关性分析比较DFI与其他指标的相关性，组间各指标异常率比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1不同DFI组患者精子顶体酶活性比较291例患者中，精子DFI＜10%102例（35.1%），10%～20%95例（32.6%）、＞20%～30%51例（17.5%）、＞30%43例（14.8%），各组患者精子顶体酶活性［分别为（132.4±27.6）、（99.1±20.5）、（74.4±30.1）、（51.7±44.2）μU/106］比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），且随着DFI的增加，精子顶体酶活性降低。

2.2不同DFI组患者精液常规参数比较不同DFI组患者年龄、精液体积及精液液化时间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），但不同DFI组患者A+B级精子百分率、D级精子百分率及精子头部畸形百分率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1　不同精子DFI组患者精液常规参数比较（±s）

表1　不同精子DFI组患者精液常规参数比较（±s）

注：与DFI＜10%比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与DFI 10%～20%比较，cP＜0.05，dP＜0.01。

项目DFI ＜10%　10%～20%　＞20%～30%　＞30% （n=102）　（n=95）　（n=51）　（n=43）年龄（岁）精液体积（mL）精液液化时间（min）A+B级精子百分率（%）D级精子百分率（%）精子头部畸形百分率（%）33.7±4.3 2.5±1.3 24.3±2.2 65.6±14.8 24.1±7.0 75.4±7.5 35.4±5.1 2.7±1.2 22.3±3.1 58.3±17.6 23.9±8.4 79.7±5.6 34.5±4.4 2.4±1.7 25.3±5.5 42.5±11.5ac45.4±13.7ac84.8±9.5a35.7±3.9 2.7±1.1 22.3±4.8 30.7±18.8bd59.8±18.5bd89.7±7.4ac

2.3DFI与顶体酶活性及精液常规参数的相关性A+ B级精子百分率及顶体酶活性与DFI呈负相关［相关系数（r）=-0.305、-0.352，P＜0.01］；D级精子及精子头部畸形百分率与DFI呈正相关（r=0.284、0.157，P＜0.01）。见表2。

表2　DFI与顶体酶活性及精液常规参数的相关性

3　讨　论

男性因素引起的不育接近50%，导致男性不育的因素较多，其中因精液异常导致不孕较为常见，因而评估男性生育能力的重要标准是对精液质量进行分析。但在临床诊断和实验室检查方面，许多缺陷仍然存在。当前主要是采用光学显微镜检测精子存活率、活动力和形态、密度等评价精液质量，这些精液常规检查结果存在较大误差，重复性、可靠性差，因此尚无法准确、全面评估男性生育能力及精液质量。

精子顶体酶为特化溶解酶，包括50多种水解酶，其活性高低与精子对卵细胞的穿透能力相关，因而目前将精子顶体酶活性测定作为精子质量的一项重要指标。影响顶体酶活性的因素较多，有先天性因素，如先天性小头精子等，而临床上更多见的是后天因素，如精子密度、精子活力、精子畸形率、生殖道各种原因感染、精液酸碱度（pH）、精子活率、精液液化状态、精液中白细胞数等均与精子顶体酶活性有关［12］。

本研究结果证实，精子顶体酶活性与DFI呈负相关，即精子顶体酶活性与精子DNA损伤程度呈反比。通常将精子顶体酶活性下降30%以上作为精子DNA损伤的正常临界值。本研究结果显示，精子DNA损伤大于30%时，精子顶体酶活性明显下降，D级精子百分率明显升高，而A+B级精子百分率明显降低，同时精子头部畸形百分率上升显著。上述精子形态学及顶体酶活性与DFI相关的结果表明，精子质量评价指标可以包括独立的精子DNA损伤，也可以结合其他精子评价指标，为男性不育的辅助生殖技术及诊断提供了理论依据。然而，精子DNA损伤对精子顶体酶活性产生影响的原因目前尚不清楚，有待于进一步的研究揭示其调控通路及作用机制。

［1］世界卫生组织.世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册［M］. 5版.北京：人民卫生出版社，2011：5-20.

［2］ Komiya A，Watanabe A，Kawauchi Y，et al.Sperm with large nuclear vacuoles and semen quality in the evaluation of male infertility［J］.Syst Biol Reprod Med，2013，59（1）：13-20.

［3］Pons I，Cercas R，Villas C，et al.One abstinence day decreases sperm DNA fragmentation in 90%of selected patients［J］.J Assist Reprod Genet，2013，30（9）：1211-1218.

［4］Wyrobek AJ，Eskenazi B，Young S，et al.Advancing age has differential effects on DNA damage，chromatin integrity，gene mutations，and aneuploidies in sperm［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（25）：9601-9606.

［5］Maettner R，Sterzik K，Isachenko V，et al.Quality of human spermatozoa：relationship between high-magnification sperm morphology and DNA in tegrity［J］.Andrologia，2014，46（5）：547-555.

［6］Viloria T，Garrido N，Fernández JL，et al.Sperm selection by swim-up in terms of deoxyribonucleic acid fragmentation as measured by the spermchromatin dispersion test is altered in heavy smokers［J］.Fertil Steril，2007，88（2）：523-525.

［7］Saleh RA，Agarwal A，Sharma RK，et al.Evaluation of nuclear DNA damage in spermaozoa from infertile men with varicocele［J］.Fertil Steril，2003，80（6）：1431-1436.

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［9］Enciso M，Muriel L，Fernández JL，et al.Infertile men with varicocele show a high relative proportion of sperm cells withintense nuclear damage level，evidenced by the sperm chromatin dispersion test［J］.J Androl，2006，27（1）：106-111.

［10］Agbaje IM，Rogers DA，McVicar CM，et al.Insulin dependant diabetes mellitus：implications for male reproductive function［J］.Hum Reprod，2007，22（7）：1871-1877.

［11］Kort HI，Massey JB，Elsner CW，et al.Impact of body mass index values on sperm quantity and quality［J］.J Androl，2006，27（3）：450-452.

［12］陈可，包华琼，丁杰，等.精子顶体酶活性与精液常规检查参数关系分析［J］.中国医学创新，2011，8（14）：8-10.

Analysis of correlation between sperm DNA damage with acrosin activity and semen parameters*

Zhuang Xiwei，Li Zhiquan（Chancheng District Central Hospital，Foshan，Guangdong 528031，China）

ObjectiveTo investigate the correlation between DNA damage in sperm with acrosin activity and routine semen parameters.MethodsSemen was collected from 291 male infertility patients in our hospital from January 2013 to April 2015.Semen morphology，density，vitality and semen routine were analyzed.Sperm DNA damage was detected by using sperm chromatin dispersion（SCD）method.The correlation between DNA damage with acrosin activity and semen routine parameters was analyzed.ResultsThe sperm DNA fragmentation index（DFI）had no relation with the age，semen volume and semen liquefaction time，while had a negative correlation with the crosin activity and the percentage of level A plus level B sperm（r=-0.352，-0.305，P＜0.01），and a positive correlation with sperm head deformity and the percentage of level D sperm（r=0.157，0.284，P＜0.01）.ConclusionSperm DNA damage can include the independent sperm DNA damage and also can combining with other semen evaluation indicators，which provides the theoretical basis for diagnosis of male infertility and assisted reproductive technology（ART）.

DNA；Semen/chemistry；Acrosin；Sperm count；Sperm motility；Sperm head；Infertility，male；Sperm DNA fragmentation index

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.01.005

A

1009-5519（2016）01-0014-02

广东省佛山市卫生局医学科研课题（2014183）。

庄锡伟（1983-），主管技师，主要从事临床检验工作。

（2015-11-19）