骆雨欢，李　乐△，杨　巍

(1.浙江工业大学药学院，杭州 310014;2.浙江大学药学院，杭州310058)



瞬时感受器电位M2通道抗原位点的兔单抗特异性检测*

骆雨欢1，李乐1△，杨巍2

(1.浙江工业大学药学院，杭州 310014;2.浙江大学药学院，杭州310058)

目的：筛选特异性较高的抗体以推动对瞬时感受器电位M2(TRPM2)通道结构和功能的研究。方法：以野生型昆明种小鼠大脑皮层、人胚肾293细胞、未诱导的TRPM2细胞及四环素诱导的TRPM2细胞为标本，采用免疫印迹和免疫荧光方法，以被检测抗体为一抗，荧光分子结合的抗体为二抗，根据170kD(TRPM2通道蛋白分子量)位置上是否有特异性条带，检测兔单抗的特异性。结果：抗体98927对鼠源TRPM2通道有特异性，抗体40622,抗体98721,抗体98921对人源TRPM2通道有特异性，另外抗体98721对鼠源TRPM2通道的突变型有特异性。结论：作为分子探针，抗体98927、40622、 98721、 98921可用于TRPM2通道结构和功能研究。

TRPM2通道；兔单抗；特异性；免疫印迹

瞬时感受器电位M2型(transient receptor potential melastatin type2,TRPM2)通道是具有二磷酸腺苷核糖(adenosine diphosphoribose,ADPR)水解酶活性的非选择性阳离子通道。广泛存在于脑组织、粒细胞和巨噬细胞中。此通道在氧化应激反应中被激活,常作为细胞氧化还原感受器[1]。它由四个亚基组成，每个亚基有六次跨膜结构,在第五和第六次跨膜结构间形成P-loop环，共同构成离子通道。允许K+、Na+和Ca2+等阳离子通过。当胞内ADPR与通道蛋白结合后,TRPM2通道开放[2]。Ca2+内流，导致胰岛β细胞释放胰岛素,免疫细胞产生促炎细胞因子,内皮细胞通透性增加,小神经胶质细胞活化和细胞死亡；继而诱发糖尿病、心血管病、神经退行性疾病和中风等疾病。

大量研究表明，通道跨膜结构上氨基酸残基对通道功能起重要作用[3,4]。因此浙江希尔生物公司把通道六次跨膜结构上(尤其是P-loop环部分)的氨基酸残基作为抗原位点单抗对TRPM2通道上不同抗原位点的特异性，从中筛选出特异性高的抗体，作为研究研发出相应的21个兔单克隆抗体。本课题通过免疫印迹和免疫荧光剂技术，检测上述兔用探针，希望推动TRPM2通道结构和功能的研究。

1　材料与方法

1.1试剂

0.25%胰酶，琼脂培养基(PS培养基)，TRPM2专用培养基(Z+B培养基)，加四环素培养基(Tet培养基)，0.06 μg/ml抑肽酶(Aprotinin),牛血清蛋白(BSA)，21只待筛选抗体(一抗，浙江希尔生物公司提供)，actin抗体(美国Santa Cruz.)，与荧光分子相连的二抗(武汉博士德生物公司)。

1.2细胞株及动物

人胚肾293细胞，中科院上海生化所。清洁级昆明种小鼠四只，鼠龄8周，雌雄各半，体重18～21 g,单笼饲养，自由饮水，室温20～25℃，由浙江大学医学院神经生物研究所实验动物房提供。

1.3方法

本实验选择小鼠和人类的TRPM2通道蛋白作为检测兔单抗特异性的样本。取野生型昆明种小鼠(wide type，WT)大脑皮层组织直接作为样本。采用四环素诱导人类TRPM2蛋白表达[5]，从细胞中提取蛋白进行检测。

1.3.1组织样本制备提取WT小鼠大脑皮层进行匀浆,加入胰蛋白酶抑制剂和苯甲基磺酰氟(PMSF)。经2 000 r/min离心10 min ，上清为组织内蛋白，沉淀为细胞碎片。上清加入上样缓冲液后经高温煮沸变性，经电泳将不同分子量蛋白分离，从而与抗体接触形成不同条带。制备后-20℃保存。

1.3.2细胞样本制备由于TRPM2通道蛋白在人类体内的自然表达量不足以支持免疫印迹法来检测抗体。故需要通过四环素诱导通道表达，选取人胚肾293细胞(HEK293)和未诱导的TRPM2细胞(uninduce TRPM2)作为阴性对照，当uninduce TRPM2细胞密度长到70%左右，加入四环素诱导TRPM2通道蛋白大量表达。当细胞长到90%左右即可开始传代。首先弃去液体培养基，用Hank's液清洗细胞，再加入胰酶使细胞漂浮下来。短暂孵育后加正常培养基停止消化。离心获得细胞沉淀，用PS培养基重悬后，将HEK293细胞加入PS培养基内，uninduce TRPM2细胞加入Z+B培养基内，摇匀后放入CO2孵箱中培养。传代三次后细胞状态基本稳定，可用来作为实验细胞。三种细胞：HEK293，uninduce TRPM2,induce TRPM2,弃去培养基后用PBS冲洗2～3次。沿培养皿壁加入ripa裂解液用枪吹打数次，使裂解液和细胞充分接触，后移入37℃孵箱摇床裂解1 h，使细胞完全破裂。所得的液体按16 100×g，15 min，4℃离心，离心后取上清，加入上样缓冲液后煮沸5 min，使蛋白部分变性，即得三者样本。于-20℃保存。

取上述4种样本，分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据不同分子量分开，然后将结合在凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，后用牛血清蛋白封闭，然后抗体用5%的牛血清蛋白稀释(1∶500,100 μl)，4℃孵育过夜。一抗孵育完成后，用TBST(含吐温的Tris-HCl缓冲盐溶液)洗涤3次，每次15 min，再与荧光分子结合的二抗，按1∶5 000的效价孵育1 h，TBST洗涤3次，每次15 min。最后于扫瞄仪上显色，最终结果以各抗体条带和β-actin 的灰度比值表示抗体的特异性。

1.4统计学分析

2　结果

M:Marker;WT:Brain samples of wild type mice;HEK:HEK293;UN:Humanized cell samples without inducing the expression of the channel TRPM2;IN:Humanized cell samples of inducing the expression of the channel TRPM2

3　讨论

本实验在15个蛋白泳道上检测，TRPM2通道蛋白分子量为170 kD,所以从左向右第一个，第六个，第十一个泳道均加以量程为250的Marker，用于标记条带位置。每个抗体检测需要文中提到的四个样本，在结果图片中分别以WT、HEK、UN、IN标记。

本实验参照除Marker外，还设HEK293空白对照，针对induce TRPM2的uninduceTRPM2对照，actin作为内参及阳性对照，同时actin抗体是一种成熟的商业化抗体，其条带可以作为筛选抗体的依据。

结果显示，抗体98927对鼠源TRPM2通道有很好的特异性，抗体40622,98721,98921对人源的TRPM2通道蛋白有很好的特异性；同时，抗体98721对鼠源TRPM2通道突变型存在有很好的特异性；抗体98721同时对人源和鼠源的TRPM2通道蛋白存在特异性，可能与抗体杂质或纯度有关，抗体需要改造。本实验共筛选出98927，40622,98721,98921四种抗体，作为分子探针，可望用于TRPM2通道结构和功能的研究。

[1]Jiang LH,Yang W,Zou J,et al.TRPM2 channel properties,functions and therapeutic potentials[J].Expert Opin Ther Targets，2010,14(9):973-988.

[2]Fliegert R,Gasser A,Guse AH.Regulation of calcium signalling by adenine-based second messengers[J].Biochem Soc Trans,2007,35(Pt 1):109-114.

[3]Xia R,Mei ZZ,Mao HJ,et al.Identification of pore residues engaged in determining divalent cationic permeation in transient receptor potential melastatin subtype channel 2[J].J Biol Chem,2008,283(41):27426-27432.

[4]Yang W,Zou J,Xia R,et al.State-dependent inhibition of TRPM2 channel by acidic pH[J].J Biol Chem,2010,285(40):30411-30418.

[5]钱锋,潘卫庆.在减毒伤寒杆菌 CVD908 疫苗株中四环素诱导表达恶性疟原虫 MSP1—31 片段基因[J].第二军医大学学报,2002,23(1):51-53.

TRPM2 channel;rabbit monoclonal antibody;specificity;Western blot

2015-02-11

2015-12-14

△E-mail:lile1856@163.com;Tel:0571-88320320

R446

A

1000-6834(2016)02-168-03

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.019