李云龙，李　俭，李昌盛，李静辉，孟　宇，杨焕民，李士泽,△

(1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，2.动物科技学院，大庆 163319)



冷应激条件下猪睾丸细胞中RNA结合基序蛋白3过表达对Caspase 3表达的影响*

李云龙1，李俭2，李昌盛2，李静辉2，孟宇2，杨焕民2，李士泽1,2△

(1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，2.动物科技学院，大庆 163319)

目的：探讨冷应激(32℃)条件下，猪睾丸(ST)细胞系中RNA结合基序蛋白3(RBM3)过表达时凋亡蛋白半胱天冬酶3(Caspase 3)表达量变化情况。方法：利用本实验室成功构建的携带绿色荧光蛋白(GFP)的RBM3过表达慢病毒载体pLenti6/V5-GW/EmGFP-RBM3和空病毒载体pLenti6/V5-GW/EmGFP-DEST分别感染ST细胞，作为过表达病毒(OEV)组和空载体病毒(EVV)组，此外还设立野生型细胞(WTC)组作对照，利用实时荧光定量RCR(qPCR)法和Western blot分析法检测各组中RBM3 mRNA和蛋白的表达情况。然后对各组细胞进行37℃以及32℃(2 h、4 h，8 h)的冷应激处理，利用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测各组Caspase 3表达量的变化。结果：OEV组RBM3基因和蛋白相对表达量高于EVV组和WTC组。在37℃以及32℃冷应激实验(2 h、4 h，8 h)中，OEV组Caspase 3表达量显著低于EVV组和WTC组。结论：冷应激ST细胞中RBM3过表达能够显著地降低Caspase 3的表达程度，为RBM3基因具有抵抗低温诱导ST细胞凋亡作用提供实验依据。

RNA结合基序蛋白3；冷应激；过表达；猪睾丸细胞系；半胱天冬酶3

猪对寒冷比较敏感，尤其是初生仔猪，其生存的临界温度为34℃。由于临界温度较高，仔猪体温调节机能未发育完善。所以在出生后72 h内因受冻而死的仔猪占很大比例。同时寒冷暴露也使猪的生产性能降低，易患睾丸损伤等疾病，这种情况给我国畜牧业造成的的损失不容估量[1]。当动物受到寒冷刺激时，大多数蛋白质基因的转录、翻译受到抑制，但是冷休克蛋白的表达量却显著升高。RNA结合基序蛋白3(RNA binding motif protein 3,RBM3)是在哺乳动物细胞中发现的重要冷应激蛋白，伴随着冷应激过程其表达量上调，以保护机体细胞免受低温诱导凋亡伤害[2]。RBM3在各种细胞中的表达并不相同，其在胰腺、肾上腺、胎盘和睾丸细胞中高效表达，然而在心肌、甲状腺细胞中则不表达。慢病毒是一群形态、生化特点相似，基因组结构相近的一类免疫缺陷性病毒,将慢病毒载体整合到宿主基因组中可实现基因组基因稳定长效表达,并且其具有免疫原性低、感染效率高的特点[3]。本实验室[4]已成功构建了猪RBM3过表达慢病毒载体，并初步探究了其功能。目前，猪RBM3过表达慢病毒载体在猪睾丸细胞抗低温作用中的保护作用尚不明确。本实验拟通过RBM3过表达慢病毒载体感染猪睾丸(swine testicle，ST)细胞系，实现RBM3基因的过表达。并在正常温度37℃和亚低温32℃冷暴露不同时间，检测凋亡蛋白Caspase 3的表达量，以探究RBM3过表达与Caspase 3表达量变化的关系以及对ST细胞凋亡的影响。

1　材料与方法

1.1主要试剂与仪器

氨苄青霉素购自美国Spanish公司，胰蛋白酶购自美国Gibco公司，胎牛血清FBS和MEM培养液购自美国Hyclone公司，荧光定量试剂盒购自大连宝生物有限公司，Caspase 3酶联免疫吸附试剂盒购自深圳绿诗源生物技术有限公司，BCA蛋白定量试剂盒、ECL试剂盒均购自中国碧云天生物技术有限公司，聚丙烯凝胶电泳SDS-PAGE配置试剂盒、二抗辣根酶标记山羊抗鼠lgG抗体均购自南京生兴生物技术有限公司，一抗RBM3鼠抗蛋白单克隆抗体、一抗GAPDH鼠抗蛋白单克隆抗体均购自英国Abcam公司。

1.2非慢病毒感染及重组慢病毒感染ST细胞

用收集到的慢病毒液(病毒滴度都为108PFU/ml)对目的细胞进行预感染实验，寻找最佳的感染复数(multiplicity of infection，MOI)。实验发现，预达到ST细胞慢病毒感染率95%以上时，病毒最佳感染的MOI均为20。第1天，在24孔板中接种ST细胞，分为过表达病毒组(overexpression virus，OVE)，空载体病毒组(empty vector virus，EVV)和野生型细胞组(wildtype cell，WTC)三组，每组各做三个重复孔。每孔接种5～7×104个ST细胞，细胞培养基体积100 μl，铺板时的细胞的融合率约50%，加入慢病毒感染细胞时要求细胞的融合度约为70%。第2天，观察细胞的生长状态，在细胞状态较好的情况下开始实验。用移液器吸取病毒载体加入细胞培养液MEM中，以便得到准确浓度的病毒载体稀释液。吸弃OEV和EVV组细胞培养板中细胞培养液，用PBS缓冲液冲洗2次，然后在OEV组和EVV组培养孔中分别加入对应MOI值的携带绿色荧光蛋白(GFP)的RBM3过表达慢病毒载体pLenti6/V5-GW/EmGFP-RBM3和空病毒载体pLenti6/V5-GW/EmGFP-DEST稀释液，在WTC组中加入纯细胞培养液，混匀后放入37℃细胞培养箱中孵育12 h。孵育完成后，将各组细胞培养液换成含10%FBS的MEM培养液，然后再次将24孔板放入37℃培养箱中孵育24 h，将OVE组的细胞置于荧光显微镜下观察感染效果。

1.3qPCR 检测 RBM3基因表达

感染24 h后吸弃三组细胞培养板中的上清液，加入Trizol 裂解细胞，抽提 RNA，检测 RNA 浓度及纯度。通过反转录获得相应的cDNA 作为模板，目的基因为 RBM3(GenBank登录号为:NM_001243419)，其上游引物为Forward:5’-CCAATCCAGAACATGCTTCA -3’，下游引物为Reverse:5’-CCTCCAGGTCGACTGTCATAT-3’；内参基因为GAPDH(GenBank登录号为:NM_001206359)，其上游引物为Forward:5’-CTCTGGCAAAGTGGACATTG -3’，下游引物为Reverse:5’-GGGTGGAATCATACTGGAACA-3’。通过 RT-PCR 预实验，摸索各引物 PCR 扩增的最佳条件。 扩增的RBM3片段长度为199 bp，扩增的内参基因GAPDH片段长度为86 bp。在 Eppendorf Real-plex 上以 SYBR Green 法进行 qPCR，分析基因的表达量。反转录条件为：94℃预变性10 s，94℃变性5 s，56℃退火30 s，72℃延伸20 s，共45个循环。反应结束后，获得每个样本的Ct值，按下列公式计算△△Ct=△Ct1-△Ct2，再计算2-△△ct，即表示目的基因在处理组与对照组的相对比。其中△Ct1=目的基因实验组-内参基因实验组，△Ct2=目的基因对照组-内参对照组。

1.4Western blot检测 RBM3蛋白表达

采用Western blot分析方法,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白(GAPDH)为内参蛋白,检测各实验组RBM3的表达情况。先提取各实验组细胞总蛋白,然后用BCA试剂盒测定蛋白质的浓度,经SDS-PAGE电泳后转PVDF膜,迅速将蛋白膜放入盛有5%的脱脂奶粉溶液中室温振荡封闭1 h，先加入一抗(RBM3鼠抗)室温下摇床摇动孵育2 h,再加入二抗(辣根酶标记山羊抗鼠IgG)室温下摇动孵育1 h,最后将 PVDF 膜经ECL法发光显色，利用凝胶成像系统采集图像并且分析。

1.5ELISA法检测冷应激条件下ST细胞中Caspase 3的表达量

ST细胞感染慢病毒24 h后，转为32℃亚低温培养。在37℃以及32℃培养2 h、4 h、8 h时，分别取细胞培养液上清200 μl，用Caspase 3 ELISA试剂盒及分光光度计检测Caspase 3基因的表达量。

1.6统计学处理

2　结果

2.1重组慢病毒感染ST细胞结果

慢病毒感染24 h之后，将培养板置荧光显微镜下观察感染效率。观察发现，感染效率约为95%，可以进行后续实验(图1)。

Fig.1Appearance of ST cells which were infected by virus(×20)

A：Normal microscope；B：Fluorescence microscope;ST:Swine testicle

2.2各组细胞RBM3基因表达

OEV组RBM3基因mRNA的相对表达量为2.45±0.10，显著高于其他两组(P<0.01)；WTC组和EVV组RBM3基因mRNA的相对表达量分别为1.00±0.05和1.07±0.06，两组间无统计学差异(图2)。

2.3各组 RBM3蛋白表达

WTC组，EVV组和OEV组均检测到RBM3蛋白的表达，但OEV组目的蛋白表达量显著高于WTC组和EVV组(图3)。

**P<0.01 vs WTC group；##P<0.01 vs EVV group

Fig.3Expression of RBM3 protein in every experimental group

1:WTC group;2:EVV group;3:OVE group;WTC:Wild type cell;EVV:Empty vector virus;OVE:Overexpression virus;RBM3:RNA binding motif protein 3

2.4冷应激条件下ST细胞中Caspase 3表达量的变化

在正常培养温度37℃以及在32℃冷应激实验(2 h、4 h，8 h)细胞培养过程中Caspase 3表达量在EVV组和WTC组无统计学差异，而OEV组Caspase 3表达量显著低于相应温度与时间点时的EVV和WTC组(P<0.05，P<0.01，表1)。

Tab.1　Expression of Caspase3 in ST cells under 37℃ and 32℃ for different times(pmol/L,±s,n=3)

WTC:Wild type cell;EVV:Empty vector virus;OVE:Overexpression virus;ST:Swine testicle

*P<0.05，**P<0.01 vs WTC group；#P<0.05，##P<0.01 vs EVV group

3　讨论

研究者发现RBM3在机体抵御外界寒冷刺激过程中发挥着重要的作用，随着环境温度降低RBM3表达量升高，以抵抗低温诱导的细胞凋亡。Ferry 等[5]研究了RBM3在成肌细胞凋亡中的作用，发现RBM3过表达可以减少星孢菌素应激引起的细胞凋亡；Chip等[6]研究发现，低温应激时神经元中RBM3上调在低温诱导的神经保护阻止细胞凋亡中有重要作用，证实RBM3保护作用与细胞抵抗凋亡的关系。外界应激(例如紫外照射、缺氧应激、冷应激等)都能引起机体或细胞迅速发生应激反应，导致机体或细胞相应代谢水平的变化，从而保护机体或细胞免受应激损伤[7]，体外冷应激培养细胞的存活温度为28℃～33℃，因此本实验选择研究32℃不同时间点细胞发生的应激变化，通过重组慢病毒感染实现了RBM3基因在ST细胞中稳定的过表达，以此为细胞模型，探讨冷应激条件下ST细胞RBM3表达量变化对细胞Caspase 3含量的影响，进而证实RBM3抗细胞凋亡的保护作用。Caspase 3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，在哺乳动物5大主要细胞凋亡途径中发挥着举足轻重的作用[8]。本研究实现了RBM3在ST细胞中基因和蛋白水平的过表达，通过37℃以及32℃不同时间点检测Caspase 3的表达情况发现，Caspase 3表达量在EVV组和WTC组无统计学差异，而OEV组Caspase 3表达量显著低于相应温度与时间点时的EVV和WTC组。Dresios 等[9]研究证实,在37℃或32℃的情况下，RBM3通过结合60 s核糖体亚基并且改变多聚核糖体切面结构,直接影响翻译水平从而影响蛋白质的合成。本研究证明RBM3在正常温度以及亚低温条件下可能通过与Caspase 3直接或间接的作用来减少其表达，从而抑制细胞的凋亡。

环境低温直接影响畜牧养殖业的发展，具体表现为在低温环境下动物生产能力降低、性发育减缓、机体代谢异常，动物易患支气管炎、关节炎、冻伤、风湿病等疾患，严重时可致使动物死亡，如应对不利将给国民经济造成巨大损失。据不完全统计，每年因冷暴露给全球畜牧养殖业造成的经济损失高达数十亿美元。因此，近年来低温对畜牧养殖业造成的危害引起人们的重视。然而，至今尚无有效防治冷害的方法。本实验从分子层面入手，初步研究了亚低温条件下RBM3在ST细胞中过表达能够显著地降低凋亡蛋白Caspase 3的表达量，从而保护细胞免受低温诱导的凋亡。为在寒区畜牧业发展过程中制造RBM3动物制剂，保护动物免受低温冻伤提供理论依据。

[1]刘莉莉,初芹,徐青，等.动物冷应激的研究进展[J].安徽农业科学,2012,40(16):8937-8940.

[2]李云龙,李昌盛,李静辉,等.RNA结合基序蛋白3的生物学功能[J].生理科学进展,2014,45(6):429-433.

[3]Cockrell AS,Kafri T.Gene delivery by lentivirus vectors[J].Mol Biotechnol,2007,36(3):184-204.

[4]李俭,杨玉英,李玉恒，等.RBM3重组慢病毒载体的构建、包装和鉴定[J].应用与环境生物学报,2014,20(4):590-596.

[5]Ferry AL,Vanderklish PW,Dupont-Versteegden EE.Enhanced survival of skeletal muscle myoblasts in response to overexpression of cold shock protein,RBM3[J].Am J Physiol Cell Physiol,2011,301(2):C392-402.

[6]Sureban SM,Ramalingam S,Natarajan G,et al.Translationregulatory factor RBM3 is a proto-oncogene that prevents mitotic catastrophe[J].Oncogene,2008,27(33):4544-4556.

[7]Lleonart ME.A new generation of proto-oncogenes:cold-in-ducible RNA binding proteins[J].Biochim Biophys Acta,2010,1805(1):43-52.

[8]Chip S,Zelmer A,Ogunshola OO,et al.The RNA-binding protein RBM3 is involved in hypothermia induced neuroprotection[J].Neurobiol Dis,2011,43(2):388-396.

[9]Dresios J,Aschrafi A,Owens GC,et al.Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits,alters microRNA levels,and enhances global protein synthesis[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(6):1865-1870.

Effect of RNA binding motif protein 3 overexpression on Caspase 3 expression in swine testiclar cell under cold exposure

LI Yun-long1，LI Jian2，LI Chang-sheng2，LI Jing-hui2，MENG Yu2，YANG Huan-min2，LI Shi-ze1,2△

(1.College of Life Science and Technology,2.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China)

Objective:To investigate the change of apoptosis protein(Caspase 3)expression when RNA binding motif protein 3(RBM3)overexpression in swine testicle(ST)cell line under cold stress(32℃)condition.Methods:In present study,RBM3 overexpression lentiviral vector(pLenti6/V5-GW/EmGFP-RBM3)and empty viral vector(pLenti6/V5-GW/EmGFP-DEST)with green fluorescent protein(GFP)that were successfully constructed in our laboratory were transfected into ST cells as overexpression virus group(OEV),empty vector virus(EVV)group and establishment of wildtype cell(WTC)group as the control group.The real-time fluorescence quantitative RCR(qPCR)and Western blot were used to detect expression of RBM3 mRNA and protein in each group,then cells in each group were cultured at 37℃ or 32℃(2 h,4 h,8 h),the changes of Caspase 3 expression in each group were detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).Results:Relative RBM3 gene and protein expression in OEV group were significantly higher than those in EVV group and WTC group.At the temperature of 37℃ and at 32℃(2 h,4 h,8 h)in cold stress experiment,Caspase 3 expression in OEV group was significantly lower than those in EVV group and WTC group.Conclusion:RBM3 overexpression in ST cell line exposured to cold can significantly decreased the level of Caspase 3 expression,this study provides an experimental basis of RBM3 resistance against apoptosis of ST cells induced by low temperature.

RNA binding motif protein 3；cold stress；overexpression；swine testicular cell line；Caspase 3

国家自然科学基金项目(31272524)；农业部948计划重点资助项目(2011-G35)；黑龙江省自然科学基金项目(C201103)；研究生创新基金项目(YJSCX2014-Y25)

2015-01-07

2015-09-30

△Tel：0459-6819230；E-mail：lishize1@sina.com

Q494

A

1000-6834(2016)02-102-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.002