张海天 王国祥 杨欣 邱满堂 许林

本课题组在前期研究中发现磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5（glypican-5, GPC5）在非小细胞肺癌中扮演着抑癌基因的角色，且GPC5在非小细胞肺癌组织中显著低表达，而过表达GPC5可以显著抑制肺癌细胞的侵袭和迁移能力[1]。此后，陆续有研究[2,3]报道GPC5在肺癌中低表达且具有抑癌基因样作用。

目前的研究多认为GPC5是一个转移抑制因子，而GPC5对细胞增殖影响的研究较少；此外，GPC5的具体分子生物学机制尚未明确。因此，在本研究中我们构建了稳定高表达GPC5的肺腺癌A549细胞株，通过细胞生物学实验和高通量转录组测序手段来研究GPC5对肺腺癌细胞增殖能力和基因表达的影响

1 材料与方法

1.1 实验材料 人肺腺癌细胞株A549购于中国科学院上海细胞库；慢病毒载体及稳定转染细胞株由上海吉凯生物公司完成；RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司。1640培养基和胎牛血清购于Gibco公司，Cell Counter Kit8（CCK8）和EdU试剂盒购于南京凯基生物公司。

1.2 细胞培养 肺腺癌细胞株A549在含10%FBS的1640培养液中，37oC、5%CO2保持饱和湿度培养，2天-3天传代一次[4]。

1.3 CCK8实验 将处于对数生长期的细胞接种于96孔板，每孔接种3,000个细胞，每组设置5个复孔；分别在接种细胞贴壁后的0 h、24 h、48 h、72 h、96 h吸去培养基，每孔加入100 μL培养液和10 μL CCK8试剂，孵育2 h后使用自动酶标仪检测450 nm波长处吸光值[5]。

1.4 平板克隆实验 将处于对数生长期的细胞接种于6孔板，每孔接种200个细胞，每4天换液一次。2周后吸去培养基，使用甲醇将细胞克隆固定，然后用结晶紫染液染色，计数每个孔中克隆形成数目并拍照。

1.5 EdU实验 将处于对数生长期的细胞均匀接种与盖玻片上，待细胞贴壁后使用凯基EdU试剂盒进行染色固定并拍照。……