杨　玲　尹春元　吕　欣　张贵晨

(北京市昌平区医院重症医学科，北京102200)



生脉注射液联合去甲肾上腺素对多器官功能障碍综合征大鼠淋巴细胞凋亡及凋亡蛋白的影响

杨玲尹春元吕欣张贵晨①

(北京市昌平区医院重症医学科，北京102200)

①北京市朝阳医院外科重症监护一病区，北京100020。

目的：研究生脉注射液联合去甲肾上腺素对多器官功能障碍综合征大鼠细胞免疫的影响。方法：选取40只健康雄性大鼠，通过应用酵母多糖腹腔注射致MODS模型，采用数字表法随机分为对照组、生脉注射液组、去甲肾上腺素组以及生脉注射液联合去甲肾上腺组， 每组10只。用药后6、24、48 h检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-12和IL-2的浓度，免疫组化检测大鼠脾脏caspase-3、caspase-8、caspase-9活性，流式细胞技术测定淋巴细胞凋亡情况及Th1/Th2。结果：①与对照组相比，生脉注射液组、去甲肾上腺组以及联合用药组，TNF、IL-1β浓度上升不是很明显，且随着治疗时间的延长，治疗各组TNF、IL-1β浓度逐渐下降，联合用药组TNF、IL-1β基本趋于正常；而IL-12、IL-2趋势则相反，治疗各组较对照组血清IL-12、IL-2浓度明显升高，联合用药组升高更加明显。②与对照组相比，生脉注射液组、去甲肾上腺素组以及联合用药组caspase-3、caspase-8、caspase-9表达均显著减少，且联合用药组凋亡蛋白的表达下降更明显，差异有统计学意义(P<0.05)。③生脉注射液组、去甲肾上腺素组以及联合用药组淋巴细胞凋亡的阳性细胞数比率较对照组明显减少，联合用药组淋巴细胞凋亡的阳性细胞数减少较生脉注射液组以及去甲肾上腺素组更明显；相比于对照组，生脉注射液组、去甲肾上腺素组以及联合用药组Th1/Th2 比率明显增高，联合用药组增高更明显，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：生脉注射液联合去甲肾上腺素对多器官功能障碍大鼠具有减轻炎症反应和改善免疫功能的作用。

多器官功能障碍；生脉注射液；去甲肾上腺素；免疫功能

多器官功能障碍综合症(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)是指机体遭受严重感染、创伤、休克、大手术等损害24 h后，同时或序贯发生两个或两个以上器官或系统功能不全或衰竭的临床综合征，是重症监护病房(Intensive care unit，ICU)患者发病和死亡的一个重要原因。MODS的发病率高、预后差，在ICU成年患者中的发生率为11%～40%，是当今外科ICU病房首要的死亡原因，约占50%～80%[1]，在我国MODS的病死率超过60%[2]。目前对于MODS的了解，认为它是一种连续的生理紊乱状态，但具体的发病机制尚未完全明了。近些年来，国内外学者关于MODS免疫系统损伤的研究，发现患者病程早期大量免疫细胞的过度反应致使炎症反应失衡，从而诱发全身炎症反应综合征(SIRS)；而在病程后期， 由于免疫细胞过度损耗及功能的变化又引起免疫防御系统的严重损伤，发展为免疫抑制或免疫麻痹，最终导致MODS[3-5]。因此关于MODS的免疫失衡与调节机制，已成为当前MODS与创伤医学研究中的重要课题。

生脉注射液主要有效成分为红参、麦冬、五味子3味中药，具有益气养阴，复脉固脱功能。临床上主要用于治气阴两亏、脉虚欲脱的四肢厥冷、汗出、心悸、气短、心肌梗死、感染性休克等具有上述症状的临床病理状态。由于生脉注射液的广泛应用，对其药理作用的实验研究亦得到了许多学者的重视。研究发现，生脉注射液具有保护缺血再灌注细胞、减少心肌细胞凋亡等功能。另外学者段顺元等[6]研究发现，生脉注射液可降低糖尿病肾病患者血清的TNF-α、IL-6 水平，且TNF-α、IL-6 的降低与24 h尿蛋白量的降低及疗效呈正相关。提示生脉注射液可抑制患者炎性细胞因子的产生，并具有免疫调节功能和消炎作用。这些研究表明，生脉注射液对机体的免疫状态以及免疫细胞的功能及凋亡有一定影响。基于这些研究，本实验通过构建MODS模型大鼠，研究生脉注射液对MODS大鼠的免疫功能的影响。

1　材料与方法

1.1材料μ-Quant 酶标分光光度仪(美国 Bio-Tek公司)、ELISA试剂盒(美国Abcam公司)，caspase-3、caspase-8和caspase-9多克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，二抗为生物素标记羊抗小鼠IgG(Santa Cruz 公司)。

1.2方法

1.2.1动物模型构建健康雄性SD大鼠40只，体质量240～280 g，由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供，符合国家医用动物使用标准(许可证号：SCXK[鄂]2012- 2014，级别：SPF)。参照并改良陈德晖等“二次打击”方法和标准制备MODS大鼠模型[7]：采用左眼球取血2 ml/100 g，4 h后以5 mg/kg腹腔注射LPS。对照组予以腹腔注射等量的生理盐水。建模后，随机分为对照组、生脉注射液组(2 ml/只)、去甲肾上腺素组(3 mg/kg)、生脉注射液(2 ml/只)及去甲肾上腺素(3 mg/kg)联合用药组，每组10只。静脉分别应用相应药物，分别于6、24、48 h将动物腹腔注射3%戊巴比妥钠(30 ms/kg)麻醉后，常规消毒皮肤，对应时间点摘眼球眼底动脉取血，EP管采集，静置30 min，离心(3 000 r/min，15 min)分离血清，-20℃贮存。脱臼处死小鼠，分离脾脏，剪取部分入无菌、无酶冻存管，超低温冰箱保存备用；部分石蜡包埋，冰冻后切冰冻切片，-70℃保存；部分用10%中性甲醛溶液固定，用于组织形态学观察；其余用于提取T淋巴细胞。

1.2.2炎性细胞因子检测采用 ELISA(酶联吸附法)检测各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-12 和IL-2的含量，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.2.3脾脏caspase-3、caspase-8和caspase-9活性检测采用免疫组织化学染色法检测。将脾脏石蜡切片分别脱蜡、内源性过氧化物酶封闭后，分别滴加caspase-3、caspase-8和 caspase-9多克隆抗体(滴度1∶100)，PBS代替一抗做阴性对照。40℃过夜后滴加二抗(滴度1∶200)，DAB显色。采用彩色病理图像分析系统对切片进行图像分析。

1.2.4淋巴细胞凋亡检测取无菌脾脏粉碎处理，经400目不锈钢筛网过滤制成单细胞悬液，按20 μl/107细胞的量，加入抗小鼠T细胞微磁珠分选T淋巴细胞。按凋亡试剂盒说明书标记淋巴细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡，操作方法按照试剂说明书。

1.2.5淋巴细胞亚群检测取上述分选出的T淋巴细胞悬浮液，同时采用CD4、CD8和IFN-γ抗体结合FITC荧光标记检测收集的血液标本中的Th1细胞；CD4、CD8和IL-4抗体结合PE荧光标记检测收集的血液标本中的Th2细胞。

2　结果

2.1MODS模型大鼠症状和体征腹腔注射内毒素后，各组动物相继出现烦躁、流涎、稀便、呼吸增快，最后出现活动抑制、呼吸减慢及尿少等MODS的表现。实验动物大鼠脾脏病理变化见图1。

2.2各组大鼠不同时间点血清各细胞因子的浓度用药前检测各组大鼠血清细胞因子，各组细胞因子浓度无明显差异。与对照组相比，生脉注射液组、去甲肾上腺组以及联合用药组，TNF、IL-1β浓度上升不是很明显，且随着治疗时间的延长，治疗各组TNF、IL-1β浓度逐渐下降，联合用药组TNF、IL-1β基本趋于正常；而IL-12、IL-2趋势则相反，治疗各组较对照组血清IL-12、IL-2浓度明显升高，联合用药组升高更加明显。结果见图2。

2.3各组淋巴细胞凋亡的情况以及Th1/Th2比率比较生脉注射液组、去甲肾上腺素组以及联合用药组淋巴细胞凋亡的阳性细胞数比率较对照组明显减少，联合用药组淋巴细胞凋亡的阳性细胞数减少较生脉注射液组以及去甲肾上腺素组更明显；相比于对照组，生脉注射液组、去甲肾上腺素组以及联合用药组Th1/Th2 比率明显增高，联合用药组增高更明显，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

图1　MODS大鼠各时相脾脏的病理变化(HE，×200)Fig.1　Pathological changes in spleen 6h,24h,48h after induction of MODS in rats (HE,×200)Note: A.MODS 6 h;B.MODS 24 h;C.MODS 48 h.

图2　各组大鼠不同时间点血清各细胞因子的浓度Fig.2　Plasma concentration of TNF,IL-1β，IL-12，IL-2 in 0 h,6 h,24 h,48 h after treatment in MODS rats

表1　各组大鼠脾脏凋亡蛋白检测Tab.1　Expression of caspase-3,caspase-8,caspase-9 in each group

表2　各组大鼠淋巴细胞凋亡的阳性细胞数比较(个/400倍野)以及Th1/Th2 比较(%)Tab.2　Lymphocyte number of positive apoptosis and Th1/Th2 ratio in each group(%)

3　讨论

MODS是临床常见的急危重症，发病率有逐年上升的趋势，是ICU的一个主要死亡原因，近20年来的研究显示，MODS的病死率仍高达70%左右[8]，成为现代危重病医学中的重点和焦点问题。由于MODS发病的确切机制尚未完全阐明，因此对其发病机制的研究一直是国内外研究的热点，研究者从不同角度提出了MODS的发病假说，主要有缺血- 再灌注损伤假说[9]、内毒素假说[10]、胃肠道假说[11]、炎症失控假说[12]、免疫失衡学说[13]，二次打击学说[14]、代偿性抗炎反应学说[15]等，炎症机制以及免疫失衡的探讨一直成为研究 MODS 的热点。

生脉注射液以红参、麦冬为主要原料提炼而成。早期研究发现，生脉注射液主要用于改善心血管疾病，具有保护心肌细胞、减少心肌细胞凋亡、防止心肌钙超载等疗效[16]。最近学者研究发现，生脉注射液能够调节癌症患者的免疫功能[17]。生脉注射液对晚期癌症化疗患者具有保护和增强免疫功能的作用。其主要是通过调节患者体内各种与免疫相关的细胞因子的水平，从而调节免疫功能，保护心、肾、肝等主要脏器的功能。另外有学者发现生脉注射液能抑制促炎因子的产生以及促进抗炎因子的产生，从而维持机体炎性因子的动态平衡，避免机体损伤引起的全身炎症反应[18]。

基于以上这些研究，本实验通过构建MODS大鼠模型，观察生脉注射液对MODS大鼠免疫功能的影响。根据ELISA、IHC以及流式细胞术结果发现，早期炎症因子TNF、IL-1β在MODS明显高表达，而生脉注射液能明显抑制机体产生这些炎症因子，生脉注射液联合去甲肾上腺素抑制作用更明显，从而减轻MODS引起机体的损伤以及免疫功能的紊乱。而生脉注射液能够促进机体分泌T细胞活化相关因子IL-2和抗原呈递细胞活性相关因子IL-12，从而使机体活化的免疫状态转化为免疫抑制和活化共存的状态，从而避免免疫活化状态时对机体各脏器的损伤[19]。

MODS引起的炎性反应早期，大量促炎因子能够引发淋巴细胞的凋亡，导致凋亡蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9等大量凋亡蛋白激活。本研究发现MODS大鼠脾脏凋亡蛋白的含量与脾脏淋巴细胞的凋亡结果是一致的。我们发现当给予大鼠去甲肾上腺素、生脉注射液以及联合两者使用时，脾脏凋亡蛋白的含量明显减少，相应的淋巴细胞凋亡的数量，以及Th1/Th2比率的升高，联合用每组药组均能改善机体免疫细胞的数量以及蛋白含量的增加。并且这些结果的改善是随着治疗时间的增加而逐步变化的。这一结果与早前学者研究发现炎症因子能够调节Th1/Th2的比率从而调节淋巴细胞凋亡，并且调节机体的反应是一致的。我们的研究发现生脉注射液组和联合用药组通过调节免疫和机体炎症因子动态的平衡，从而促进Th1/Th2的平衡，减少淋巴细胞的凋亡以及凋亡蛋白的激活，进而进一步减轻机体的炎症反应，改善机体的免疫功能[20]。

综上所述，生脉注射液可以减轻MODS大鼠的炎症反应，并且改善MODS的免疫能力。临床上去甲肾上腺素作为MODS基础用药，本研究发现当在使用去甲肾上腺素的基础上，联合应用生脉注射液能明显改善MODS大鼠的免疫状态以及免疫细胞的凋亡，从而调节大鼠体内的细胞免疫。这一结果提示我们MODS临床患者在基础应用去甲肾上腺素的同时辅助应用生脉注射液可以改善患者机体的免疫状态，从而有利于MODS患者的恢复。

[1]Sheng X,Wang N,Jian G,etal.Investigate the initiation time of continuous blood purification in the multiple organ dysfunction syndrome patients complicated with acute kidney injury[J].J Int Nep-Adr,2014,1(1):24-34.

[2]Abdo A A,Castellanos R,Rocha M,etal.Continuous venovenous hemodiafiltration in patients with multiple organ dysfunction syndrome in an intensive care unit[J].MEDICC Rev,2012,14(3):26-30.

[3]Fry D E.Sepsis,systemic inflammatory response,and multiple organ dysfunction:the mystery continues[J].Am Surgeon,2012,78(1):1-8.

[4]Whitmore LC,Goss KL,Newell EA,etal.NOX2 protects against progressive lung injury and multiple organ dysfunction syndrome[J].Am J Physiol-Lung,2014,307(1):L71-L82.

[5]Sriskandan,Altmann DM.The immunology of sepsis[J].J Pathol，2012，214:211-223.

[6]段顺元,杨铭,徐军发,等.生脉注射液对 2 型糖尿病肾病患者血液肿瘤坏死因子 α 和白细胞介素 6 的影响[J].中国临床康复,2012,9(3):172-174.

[7]郑小丹,沈宇清,曹云,等.通解口服液对多器官功能障碍综合征大鼠模型 IL-6,TNF-α 的影响[J].上海中医药杂志,2015,49(1):87-90.

[8]Coletta C,Módis K,Oláh G,etal.Endothelial dysfunction is a potential contributor to multiple organ failure and mortality in aged mice subjected to septic shock:preclinical studies in a murine model of cecal ligation and puncture[J].Crit Care,2014,18(5):511-523.

[9]Kim M,Park SW,Kim M,etal.Isoflurane postconditioning protects against intestinal ischemia-reperfusion injury and multi-organ dysfunction via transforming growth factor-beta1 generation[J].Ann Surg,2012,255(3):492-500.

[10]Coletta C,Módis K,Oláh G,etal.Endothelial dysfunction is a potential contributor to multiple organ failure and mortality in aged mice subjected to septic shock:preclinical studies in a murine model of cecal ligation and puncture[J].Crit Care,2014,18(5):511-523.

[11]Monti P,Wysocki J,Van der Meeren A,etal.The contribution of radiation-induced injury to the gastrointestinal tract in the development of multi-organ dysfunction syndrome or failure[J].Brit J Radiol,2014,31(4):420-432.

[12]An G,Nieman G,Vodovotz Y.Toward computational identification of multiscale "tipping points" in acute inflammation and multiple organ failure[J].Ann Br Eng,2012,40(11):2414-2424.

[13]Shen Y F,Cui N Q,Miao B,etal.Immune dysregulation in patients with severe acute pancreatitis[J].Inflammation,2011,34(1):36-42.

[14]Akashi M.Role of infection and bleeding in multiple organ involvement and failure[J].Br J Radiol,2014,67(12):221-230.

[15]Iskander K N,Osuchowski M F,Stearns-Kurosawa D J,etal.Sepsis:multiple abnormalities,heterogeneous responses,and evolving understanding[J].Physiologic Rev,2013,93(3):1247-1288.

[16]Chen Y,Tang Y,Xiang Y,etal.Shengmai injection improved doxorubicin-induced cardiomyopathy by alleviating myocardial endoplasmic reticulum stress and caspase-12 dependent apoptosis[J].Bio Med Res Int,2015,23(6):332-342.

[17]倪杰，张均，房宇，等.生脉联合的胸腺肽α1对高龄医院获得性重症肝炎患者细胞免疫功能及预后的影响[J].现代中西医结合杂志,2012,29(6):100-112.

[18]Zhan S,Shao Q,Fan X,etal.Development of a sensitive LC‐MS/MS method for simultaneous quantification of eleven constituents in rat serum and its application to a pharmacokinetic study of a Chinese medicine Shengmai injection[J].Biomedical Chromatography,2015,29(2):275-284.

[19]蔡玲玲，李元文，张丰川，等.苍柏湿毒清颗粒使支原体耐药菌株产生敏感化趋势以及与白介素IL-2、IL-12的相关性研究[J].中华中医药杂志,2012,28(1):53-61.

[20]Chen Y,Tang Y,Xiang Y,etal.Shengmai Injection Improved Doxorubicin-Induced Cardiomyopathy by Alleviating Myocardial Endoplasmic Reticulum Stress and Caspase-12 Dependent Apoptosis[J].Bio Med Res Int,2015,27(3):265-274.

[收稿2015-09-18修回2015-10-16]

(编辑倪鹏)

Effect of Shengmai injection combined with norepinephrine on apoptosis of lymphocyte and apoptosis protein in MODS rats

YANG Ling,YIN Chun-Yuan,LÜ Xin,ZHANG Gui-Chen.Department of ICU,Beijing Changping Hospital,Beijing 102200,China

Objective:To study the effect of the Shengmai injection combined with norepinephrine on cellular immunity in rats with multiple organ dysfunction syndrome.Methods: 40 healthy male rats were randomly divided into the control group,the Shengmai injection group,the norepinephrine group and the Shengmai injection combined with norepinephrine group of 10 rats in each group after MODS rat model were established by intraperitoneal injection of zymosan.The plasma level of TNF-α，IL-1β，IL-12 and IL-2 were detected by ELISA,and the protein expression of caspase-3,caspase-9 and caspase-8 in spleen were tested by IHC during 6 h,24 h,48 h.And the lymphocyte number of apoptosis and the ratio of Th1/Th2 were tested by flow cytometry.Results: ① Compared with the control group,the plasma concentrations of TNF and IL-1β were not significant increased in the Shengmai injection group,the norepinephrine group and the Shengmai injection combined with norepinephrine group,as the extension of treatment time,the plasma concentration of TNF and IL-1β were significant lower in treatment groups than control group .While the plasma concentration of IL-12 and IL-2 were significantly increased in treatment groups,and the combined treatment group was more obvious.② Compared with control group,the protein expression of caspase-3,caspase-9 and caspase-8 in spleen were decreased in the Shengmai injection group,the norepinephrine group and the Shengmai injection combined with norepinephrine group,and the combined treatment group was more obvious.③ The lymphocyte number of positive apoptosis were significantly decreased,and the Th1/Th2 ratio were increased in the Shengmai injection group,the norepinephrine group and the Shengmai injection combined with norepinephrine group,and the combined treatment group was more obvious.Conclusion: The Shengmai injection combined with norepinephrine can reduce the inflammatory reaction and improve the immune function in the rat with multiple organ dysfunction.

MODS；Shengmai injection；Norepinephrine；Immunity

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.010

R392.9文献标志码A

1000-484X(2016)08-1133-05

杨玲(1980年-)，女，主治医师，主要从事感染性休克、危重症产科、多脏器功能不全等相关疾病的诊治工作，E-mail：yangling2876@163.com。

及指导教师：尹春元(1966年-)，男，主任医师，主要从事感染性休克合并多脏器功能不全、重症胰腺炎等相关疾病的研究，E-mail：yinchunyuan29@163.com。