高静媛，邢磊，梁芳倩，于晓龙，孙尧，杨雨旸

· 论著 ·

RBP4基因rs17484721和rs36035572位点多态性与老年人2型糖尿病的相关性研究

高静媛1，邢磊1，梁芳倩1，于晓龙1，孙尧1，杨雨旸2

目的 探讨老年人视黄醇（维生素A）结合蛋白（RBP4）rs17484721和rs36035572位点基因多态性与2型糖尿病的关系。方法 采用聚合酶链式—变性高效液相色谱（PCR-DHPLC）技术筛查110例2型糖尿病患者和127例健康人RBP4基因rs17484721和rs36035572位点多态性；测定及比较两组患者空腹血糖水平、空腹血胰岛素水平，并计算计算体质指数（BMI）、腰臀比（WHR）及胰岛素抵抗指数。 结果 rs17484721和rs36035572两位点的突变存在强连锁不平衡。在健康组中TT-II基因型的WHR值显著高于（TC-ID）+（CC-DD）基因型（P＜0.05）。老年人2型糖尿病组单体型TT-II的频率为87.2%，明显高于老年正常健康人组78.7%，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 RBP4基因多态性可能与老年人糖尿病相关。

视黄醇（维生素A）结合蛋白4；多态性；2型糖尿病；单体型；胰岛素抵抗

2型糖尿病（T2DM）的发病受遗传及环境因素的综合作用，遗传基因可能参与调控其发病的多个环节。视黄醇（维生素A）结合蛋白基因（RBP4）是糖尿病易感基因，其非编码区的基因多态性与胰岛素抵抗相关，并在T2DM的发病中发挥着关键作用［1］，近年RBP4已作为糖尿病的候选基因正渐渐受到人们的关注。应用聚合酶链式—变性高效液相色谱（PCR-DHPLC）是近年来发展起来的一项分子生物学领域新的分析技术，是分离核苷酸片段及分析检测已知和未知基因突变和单核苷酸多态性（SNP）的最佳技术平台，与传统分子生物学技术相比具有快速、准确、敏感、高效、自动化等特点，是开展临床基因诊断的一种有效手段［2］。本研究采用PCR-DHPLC测序技术对老年2型糖尿病群体RBP4基因rs17484721和rs36035572位点多态性进行分析，探讨RBP4基因多态性与老年人2型糖尿病的关系。

1　资料与方法

1.1研究对象 选取2010年1月～2012年12月在河北理工大学附属医院老年病及内分泌科住院的老年（年龄＞65岁）2型糖尿病组患者110例及门诊查体老年（年龄＞65岁）健康组127例。糖尿病诊断标准依据1999年WHO 2型糖尿病诊断标准选择。排除标准：1型糖尿病、继发性糖尿病及患有严重心肺肾疾病。患者均签署知情同意。

1.2主要试剂 Taq DNA Polymarase（ 北京鼎国生物技术限公司）；蛋白酶K（美国Promega公司）；Tris 饱和酚（北京鼎国生物技术有限公司）；三乙铵乙酸酯（美国Transgenomic公司）；人胰岛素ELISA酶联免疫吸附测定试剂盒（上海闳巨有限公司）。

1.3临床资料收集

1.3.1一般资料 实验前采用问卷调查的方式，按照统一测量标准， 对所有研究对象分别测量身高（cm）、体重（kg）、腹围（cm）、臀围（cm）和血压（mmHg）等，计算体质指数（BMI）［3］、腰臀比（WHR）［3］。

1.3.2实验室检查 所有受试对象空腹8 h后抽取静脉血EDTA抗凝，测定空腹血糖、血脂，采用酶联免疫吸附实验（ELISA）法测定空腹血清胰岛素，计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=空腹血糖×空腹胰岛素/22.5。BMI =体重（kg）/身高2（m2）。

1.4分子生物学检查

1.4.1基因组DNA提取 常规抽取研究对象静脉血5 ml，EDTA抗凝，低渗法分离白细胞，SDS－蛋白酶K消化，用苯酚－氯仿法提取白细胞DNA后，溶于TE缓冲液，置-20℃冰箱保存［4］。

1.4.2DHPLC分析 参照GenBank中NT_030059序列设计一对用于RBP4基因第5内含子区PCR扩增的引物，正向引物序列为5'-AGGGTGCCTTC TGGCTCTTC-3'，反向引物序列为5'-CTTTA CTGGGCTGCTCAATC-3'，退火温度为45℃。把产物置于WAVETM核苷酸片段分析系统（美国Transgenomic技术有限公司）的96孔板上，输入DNA序列，根据序列用WAVEMAKER 4.0软件选择样品最佳运行温度（60.5℃）和起始洗脱梯度后，自动进样5 μl PCR产物，于DNASep分离柱（Transgenomic产品）用缓冲液A［pH7.0，0.1 mmol/L三乙胺乙酸盐（TEAA），0.1 mmol/ L EDTA-4Na］、缓冲液B（pH 7.0，0.1 mmol/L TEAA中含250 ml/L乙腈）梯度洗脱，起始梯度为58%B，以每分钟增加1.8%B的速率线性洗脱4 min，流速为0.9 ml/min，从分离柱洗脱的DNA溶液用紫外检测仪检测OD260 nm波长处。

1.4.3DNA序列分析 对DHPLC分析有异常峰型的PCR产物，行核苷酸序列测定（上海生工测序部）。

1.5统计学分析 采用SPSS11.5软件进行统计分析，利用SNPAlyze软件组建分析单倍体。计量资料用平均数±标准差（±s）表示，两组均数比较使用立样本t检验，计数资料采用例数（百分数）表示，两组率的比较采用χ2检验，以P ＜0.05为有统计学意义。

2　结果

2.1两组人群一般情况比较 健康组共有127例入组，其中男性68例，占组内人数的53.5%；糖尿病组共有110例入组，其中男性42例，占组内人数的38.2%；健康人组平均年龄与糖尿病组相比（75.91±6.39 vs. 76.11±7.99）无明显统计学差异（P＞0.05）（表1）。

表1　患者一般情况比较

2.2PCR-DHPLC筛查结果 本实验检测RBP4基因第5内含子区部分序列，发现存在rs17484721与rs36035572两个多态性位点，rs17484721位点有T、C两种等位基因，TT、TC、CC三种基因型，rs36035572有I、D两种等位基因，II、ID、DD三种基因型，且两个位点的突变存在强连锁不平衡。当rs17484721位点核苷酸为T时，rs36035572位点核苷酸总为插入的T；当rs17484721位点核苷酸为C时，rs36035572位点核苷酸总为缺失变异。本实验获3种不同类型DHPLC色谱图（图1）分别代表三种基因型，即TT-II、TC-ID、CC-DD （I：插入突变；D：缺失突变）。其中发现48例健康人、26例T2DM患者为杂合型（TC-ID）；3例健康人、1例T2DM患者为纯合型（CC-DD）；76例健康人、83例患者为野生型（TT-II）。

2.3糖尿病组与健康组间等位基因和基因型频率的比较 基因型频率分布符合哈迪-温伯格遗传平衡定律（2型糖尿病组：χ2=0.810，P=0.667；健康人组：χ2=0.403，P=0.813）。本研究人群中，BPR4基因rs1748472的C变异和rs36035572位点的缺失变异频率均为32.9%（78/237）。在老年糖尿病患者组rs17484721位点TT、TC及CC三种基因型例数为83、26及1，而健康人组为76、48 及3。在老年糖尿病患者组rs36035572位点II、ID 及DD三种基因型例数为83、26及1，而健康人组为76、48及3（表2）。利用SNPAlyze进行单体型分析后发现两位点显示强连锁不平衡（r2＞0.9）（表3）。

2.3不同基因型的临床指标比较 按单体型分组，各组之间代谢指标进行比较，在健康组中TTII基因型的WHR值显著高于（TC-ID）+（CCDD）基因型（P＜0.05）。健康组及2型糖尿病组中TT-II基因型的BMI、HOMA-IR值高于（TCID）+（CC-DD）基因型，但差异无统计学意义（表4）。

3　讨论

图1　DHPLC检测PCR产物的色谱图（1A：无突变患者色谱图；1B：纯合突变携带者色谱图；1C：杂合突变携带者色谱图）

表2　BPR4 SNPs等位基因、基因型频率与糖尿病易感性的相关性（例）

表3　病例健康人单体型分析

2型糖尿病常见于老年人，有研究数据显示60岁以上老年人糖尿病患病率可达19.6%，其主要机制为胰岛素抵抗。近年来对于老年人糖尿病及胰岛素抵抗的研究越来越受到人们重视。其中，易感基因研究成为研究热点之一。RBP4是新近发现的糖尿病易感基因，各研究数据均提示RBP4非编码区SNP位点可增加糖尿病的易感性，与胰岛素抵抗、胰岛素分泌相关［5-8］。本实验以老年人为研究对象，利用PCR-DHPLC联合测序法检测了RBP4第五内含子上的部分序列，并与胰岛素抵抗的指标进行相关性分析。结果发现RBP4基因第五内含子存在rs17484721 和rs36035572位点的变异。rs17484721位点有T、C两种等位基因，TT、TC、CC三种基因型。rs36035572有I、D两种等位基因，II、ID、DD三种基因型。

随后进行的病例健康人研究显示在2型糖尿病组中rs17484721位点TT基因型频率明显高于其它基因型频率，可认为携有TT基因型的人较其它基因型携带者更易患2型糖尿病。同样，与健康人组相比在2型糖尿病组中rs36035572的II基因型频率明显高于其它基因型频率，可认为携有II基因型的人较其它基因型携带者更易患2型糖尿病。rs1748472和rs36035572位点的最小等位基因频率均大于5%，可用来构建单体型模型。2型糖尿病组单体型TT-II的频率明显高于健康人组，健康人组CC-DD频率明显高于2型糖尿病组，揭示了单体型TT-II可能与2型糖尿病的易感性相关。rs17484721和rs36035572位于一个强连锁的区域内，且此区域包括RBP4下游基因（GPR120基因）的部分序列。已有研究显示GPR120基因编码的蛋白可刺激高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）的分泌［9-11］。目前研究提示GLP-1可促进高糖环境下的胰岛素的分泌，与糖尿病发病直接相关。推测可能本研究的位点突变引起了GPR120基因的翻译与转录。可以认为，RBP4的rs1748472和rs36035572位点可能与老年人糖尿病发病有一定相关性。

进一步分析基因多态性与代谢指标的关系发现，在健康人组中TT-II基因型组的WHR值显著高于（TC-ID）+（CC-DD）基因型，差异有统计学意义。在2型糖尿病组中也发现这种升高的趋势，但基因型组之间的差异无统计学意义。此结果揭示了TT-II基因型可能与老年人群的WHR值密切相关。本实验没有显著证据表明老年人RBP4基因多态性与胰岛素抵抗相关，这与以往研究稍有不同，但研究发现无论在健康人组还是2型糖尿病组TT-II基因型的BMI、HOMA-IR值均高于其它基因型，虽然差别无统计学意义，但这种代谢指标差异一致性不是偶然，有必要扩大样本量进一步检验。

本研究从一定角度揭示了RBP4基因与糖尿病的关系，但由于2型糖尿病属多基因遗传性疾病，每个易感基因的作用可能都是微效的，且导致并发症发生的机理受环境及个体差异影响较多。因此，有必要扩大研究对象数量，为进一步从基因水平揭示RBP4基因与糖尿病的关系提供确凿依据。

表4　糖尿病组与健康组的部分临床特征比较（±s）

表4　糖尿病组与健康组的部分临床特征比较（±s）

注：BMI：体质指数；WHR：腰臀比；FPG：空腹血浆葡萄糖；FINS：空腹血浆胰岛素；HOMA-IR：胰岛素抵抗指数。健康组TT-II亚组比较：aP＜0.05

组别亚组BMI（kg/m2）WHRFPG（mmol/L）FINS（mU/L）HOMA-IR健康组（n=127）TT-II（n=76）24.88±3.910.85±0.084.76±0.6816.71±8.212.57±2.28 （TC-ID）+（CC-DD）（n=51） 22.76±3.43 0.82±0.07a4.61±0.7012.09±9.712.08±2.07糖尿病组（n=110）TT-II（n=83）24.49±3.020.88±0.0812.11±6.2116.04±4.308.77±6.35 （TC-ID）+（CC-DD） （n=27）23.93±3.340.88±0.0912.41±6.7915.91±6.437.93±7.62

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Study on association between the rs17484721 and rs36035572 of RBP4 Gene Polymorphisms and Type2 Diabetes mellitus in old People

GAO Jing-yuan*， XING Lei， LIANG Fang-qian， YU Xiao-long， SUN Yao，YANG Yu-yang.*063000，Hebei，Tangshan，North China University of Science and Technology Affiliated Hospital .

YANG Yu-yang， E-mail: yang311605@126.com

Objective To study the associations between rs17484721 and rs36035572 of RBP4 （retinal binding protein 4） gene with Type 2 Diabetes mellitus （T2DM） in old People. Methods A combined method of polymerase chain reaction （PCR） and denaturing high performance liquid chromatography （DHPLC） was applied to detect the genotype of rs17484721 and rs36035572 among 110 T2DM patients and 127 healthy subjects. Fasting glucose and fasting insulin were measured and analyzed in two groups. Body mass index （BMI）， waist-hip ratio （WHR）and insulin resistance index were calculated. Results Strong linkage disequilibrium were found in rs17484721 and rs36035572. In health control group， the WHR was significantly higher in subjects with TT-II genotype. TTII frequency of T2DM group （87.2%） was higher than the control subjects （78.7%， P＜0.05）. Conclusions The polymorphism of RBP4 gene may be related to T2DM in old people

Retinal binding protein 4（RBP4）； Polymorphism； Type 2 Diabetes mellitus； Haplotype； Insulin resistance

· 论著 ·

R587.1

A

1674-4055（2016）04-0408-03

河北省医学科学研究重点课题（20120414）

1063000 唐山，华北理工大学附属医院老年病科；2063000 唐山，华北理工大学中医学院

杨雨旸，E-mail：yang311605@126.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.04.07