甄成　李淑娟

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨，150040)

张玉双　严善春　　孙小环　许艳玲　张雅奎

(东北林业大学)　　　　　　　　　(大兴安岭地区农业林业科学研究院)



蓝莓种间杂交及杂交种子的无菌萌发1)

甄成李淑娟

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨，150040)

张玉双严善春孙小环许艳玲张雅奎

(东北林业大学)(大兴安岭地区农业林业科学研究院)

为了培育适合北方高寒地区的蓝莓杂交新品种，以蓝莓栽培品种‘美登’、‘北蓝’、‘黑珍珠’及大兴安岭野生蓝莓为亲本进行了种间杂交。对杂种结实率、杂种果实质量、杂交种子的质量及杂交种子的萌发方法进行研究，同时结合母本自然授粉的结实情况，探究蓝莓不同杂交组合种间杂交的亲和性。结果表明：蓝莓不同种间杂交均可结实并得到杂交种子，但坐果率及单果种子数均低于自然授粉；不同种间杂交的亲和性存在较大差异，栽培品种间杂交亲和性较强，平均结实率为31.92%，其中‘北蓝’和‘黑珍珠’正反交结实率分别达到42.86%和50.03%，野生蓝莓与栽培品种间亲和性较弱，平均结实率仅为7.32%；在倍性相同情况下，相同植株类型间亲和性较强；杂交种子经100 μg·g-1赤霉素处理，接种24 d内平均出芽率达82.88%，其中‘黑珍珠’ב美登’组合出芽率达到100%。

蓝莓；种间杂交；杂交种子；无菌萌发

蓝莓(Blueberry)是杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vacciniodeae)蓝色小浆果的总称，为多年生落叶小灌木或常绿灌木，全世界约有400余种，主要分布于北半球的温带和亚热带，我国约有91个种、28个变种，主要分布于东北和西南地区[1]。其中大兴安岭野生蓝莓产量占全国总量的70%以上，占世界野生蓝莓总量的20%左右[2]。蓝莓具有极高的经济价值，其果实含有花青素、有机酸等多种生理活性成分，具有防止脑神经衰老、增强心脏功能、明目及抗癌等独特功效，被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一[3]。

蓝莓人工栽培已有百年历史，但我国蓝莓研究起步较晚。20世纪80年代以来，吉林农大、中科院南京植物所、山东省果树研究所等单位先后从美国、加拿大、澳大利亚、芬兰等国家引入蓝莓优良品种100余个，并且对蓝莓的栽培技术进行了深入研究。但我国的蓝莓育种工作仍相对薄弱，具有自主知识产权的蓝莓新品种极少[4]。此外，蓝莓种子具休眠特性，自然条件下萌发困难。刘肖等[5]的研究显示，蓝莓种子细小，出芽率低，萌发时间长，杂交种子需要55 d才能出芽，且出芽率仅为4%。因此，必须找到更有效的方法解决蓝莓种子出苗率低的难题。

本研究以3个引自国外的蓝莓栽培品种及大兴安岭野生蓝莓为亲本进行种间杂交，对不同杂交组合的结实率、果实质量、种子数量及种子质量进行研究，在此基础上，通过无菌萌发探索高效的种子育苗方法，旨在通过有性创造和无性利用对蓝莓进行遗传改良，利用杂种优势改善其遗传结构，提高其耐寒性、坐果量和果品质量，为我国北方高寒地区培育杂交新品种奠定基础。

1　试验地概况

杂交试验在大兴安岭农林科学院蓝莓试验基地进行，该基地位于黑龙江省加格达奇市南7 km处。该地区属寒温带大陆性季风气候，夏季清凉雨水较多，冬季漫长而严寒，春、夏、秋季短，年温差较大。极端最低温度-45.1 ℃，最高温度37.3 ℃，年平均气温-1.4 ℃，降水量为481.9 mm，5—8月份占全年雨量的70%以上，无霜期109 d[6]。种子的无菌萌发试验在林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)进行。

2　材料与方法

本研究选用的蓝莓杂交亲本由大兴安岭农林科学院提供，栽培品种‘美登’(‘Blomidon’)、‘北蓝’(‘Northblue’)和‘黑珍珠’(‘Blackpearl’)由浆果研究室于2010年从大连庄河引种并定植于蓝莓基地。这3个品种虽经4～5年引种驯化，但仍需采用覆土措施才能安全越冬并开花结实，2012—2014年连续3年调查，3个品种的花期基本是在5月25日—6月15日；野生蓝莓(Vacciniumuliginosum)是从大兴安岭野生分布区选优并带土挖回，定植在花盆内，以备春季提早打破休眠，使其与3个栽培品种花期一致。杂交亲本的栽培特性见表1。

表1　杂交亲本的栽培特性

杂交组合设置：以3个栽培品种‘美登’、‘北蓝’、‘黑珍珠’及野生蓝莓为亲本分别进行正反交，共设置12个杂交组合。同时，分别以各杂交亲本自然授粉为对照，每个品种分别标记30朵。

套袋及控制授粉：控制授粉于2014年5月30日—6月6日进行，当各个蓝莓品种达到始花期时，分别选取10～20株长势好的母株，每株选取3～4个发育好的花序，每个花序保留3～4朵即将开放的花蕾。去雄时将整个花被用镊子撕下来，保留子房和柱头，套袋隔离。定期观察柱头的发育状况，当绿色的柱头发亮，并有黏液渗出时即可授粉。从父本树上选取盛开的花朵，当看到黄色花粉散出时将其直接涂抹在母本柱头上，每个柱头重复授粉3次，每个杂交组合授粉100朵以上。授粉后继续套袋，防止外源花粉污染，并挂好标签，标注杂交组合及授粉日期，记录授粉个数。当子房膨大、柱头萎蔫时摘袋，并于授粉后7、30、50 d分别对受精个数、结实个数及果实质量等进行调查，以授粉后7 d子房比原来膨大1/2为受精，受精率=(子房膨大个数/授粉个数)×100%[7]；结实率=(获得果实个数/授粉个数)×100%。

果实采收及种子的储藏：果实成熟时及时采收，每个组合分别采摘并做好标记，装入透气网袋带回实验室。将采收的果实分别平铺在桌面上，保持室内通风，存放15 d左右待种子完成生理后熟收集种子，选取饱满种子在室内阴干1～2 d，密封后放置冰箱-20 ℃保存。

杂交种子的无菌萌发：将对照种子(亲本)分批次在超净台上进行消毒处理，经70%酒精消毒20 s、3%次氯酸钠处理7～8 min、无菌水清洗3遍，然后放入小三角瓶中，密封后在25 ℃、120 r·min-1的条件下震荡2 d，无菌条件下每隔3～4 h更换一次无菌水。然后用质量分数分别为0、50、100、150 μg·g-1的赤霉素溶液浸泡1 d，倒掉溶液，将种子用无菌滤纸吸干表面水分，分别接种于无激素添加的萌发培养基中，每个处理重复3次，每次接种30粒种子，培养温度为(24±1)℃，暗室培养。将对照组筛选出的最优方案用于杂交种子的无菌萌发。

3　结果与分析

3.1亲本自然授粉

亲本的自然授粉结实能力是影响杂交亲和性的重要因素之一，选择自然授粉状态下结实率高的品种作母本有利于提高杂交成功率[8]。由表2可知，本研究中各亲本的自然授粉结实率差异不明显，其中3个栽培品种结实率都在80%以上，野生蓝莓结实率为73.3%，且各品种成熟果实形态正常，同一品种内果实质量相差不明显，种子发育饱满，单果种子数量多，由此说明这些品种本身育性较好。

3.2不同杂交组合的受精结实

研究显示，与蓝莓品种自然授粉相比，种间杂交各组合受精率和坐果率均较低，且不同种间杂交存在一定差异。由表3可知，3个蓝莓栽培品种间正反交受精率平均达到65.42%，结实率平均为31.92%，其中‘北蓝’、‘黑珍珠’正反交结实率相对较高，平均结实率分别达到42.86%和50.03%，说明‘北蓝’和‘黑珍珠’杂交亲和性强；野生蓝莓与3个栽培品种正反交平均受精率为13.57%，平均结实率仅为7.32%，说明野生蓝莓与栽培品种间杂交亲和性不强。但野生蓝莓与美登正反交结实率明显高于其与‘北蓝’和‘黑珍珠’正反交结实率，暗示在倍性相同情况下，相同类型植株间的杂交亲和性更好。由表3还可以看出，受精率高的组合坐果率不一定高，例如，以‘美登’为母本的杂交组合受精率较高，但结果率却偏低，说明受精后胚的发育因亲本组合不同而异。此外，同一对亲本的正交和反交结实率也有较大差异，例如，‘美登’和‘北蓝’的正交结实率仅为其反交结实率的1/2，所以，在杂交育种中，可通过正反交设计寻找亲和性更强的杂交组合，以提高杂种结实率和种子质量。

表2　各蓝莓亲本自然授粉结实情况

表3　不同杂交组合受精率、结实率及平均单果质量

从杂交果实的单果质量来看，各杂交组合果实的单果质量多数与母本相似，这说明杂种果实特性受母本影响较大，但单凭果实质量这一性状来判断是否具有杂种优势还为时尚早，要等到杂种苗期、甚至开花结实后才能做出准确判断。

3.3杂交种子数量与质量

在所有杂交组合中，共获得杂交果实292个、杂交种子2 391粒，其中栽培品种间获得杂种果实227个，平均单果种子数8.27粒，而野生蓝莓与各栽培品种间获得杂交果实65个，平均单果种子数为6.20粒，远远低于栽培品种间的平均种子数，说明蓝莓栽培品种间杂交亲和性较强，而野生蓝莓与栽培品种杂交亲和性较弱。另外，在野生和栽培品种杂交中，野生与‘美登’杂交的平均种子数明显多于野生与另两个栽培品种，说明同为矮丛植株的‘美登’和野生蓝莓的亲和性更强，这与受精率、结实率的分析结果相一致。

通过与亲本进行对比，多数杂交种子质量与母本相近，例如，1-2、1-3两组合杂交种子质量与母本‘美登’(0.292 mg)相近;2-1、2-3两组合杂交种子质量与母本‘北蓝’(0.378 mg)相近;3-1、3-2两组合杂交种子质量与母本‘黑珍珠’(0.334 mg)相近。然而以野生蓝莓为母本，3个栽培品种为父本的杂交种子质量比母本野生蓝莓(0.285 mg)小，例如，0-1、0-2、0-3三个组合种子质量均小于母本，究其原因可能是野生与几个栽培品种间杂交亲和性不强，造成种子发育不良，种粒不饱满，这样的种子利用常规播种方法很难成苗。

表4　各杂交组合获得的杂交种子数量及质量

3.4杂交种子的无菌萌发

从表5可以看出，组培无菌萌发可以显著提高蓝莓种子的出芽率，并极大地缩短发芽时间。50、100、150 μg·g-1的赤霉素溶液均能促进种子萌发，当赤霉素质量分数为50 μg·g-1时，10 d开始出芽，出芽率为67.98%；当赤霉素质量分数为100 μg·g-1时，5 d开始出芽，出芽率为88.50%；当赤霉素质量分数为150 μg·g-1时，8 d开始出芽，出芽率为82.35%。据此确定杂交种子的赤霉素处理质量分数为100 μg·g-1。

由表6可知，经100 μg·g-1赤霉素处理后，各杂交种子无菌萌发的始出芽时间为5～7 d，持续出芽14～17 d。不同杂交组合的出芽时间差异不明显，且各杂交种子出芽率均较高，平均出芽率为80.55%，其中野生与栽培品种组合的平均出芽率为70.93%，低于平均水平；而栽培品种组合的平均出芽率为90.16%，高于平均水平，其中‘黑珍珠’ב美登’组合的杂交种子接种10 d大部分出芽，接种20 d出芽率达100%，说明栽培品种间杂交亲和性较好，种子发育较好。‘黑珍珠’ב美登’杂交组合种子萌发后的长势见图1。

表5　不同质量分数赤霉素溶液对种子萌发的影响

表6　各杂交组合种子萌发时间及出芽率

A.杂交种子接种10 d；B.杂交种子接种20 d。

4　结束语

前人研究显示，六倍体草莓在种间杂交时果实能膨大坐果，但不一定有可育种子[9]。本研究结果表明，各栽培品种间或野生与栽培品种间杂交均可结实并得到杂交种子，但不同杂交组合的坐果率及单果种子数存在较大差异。蓝莓栽培品种间杂交结实率相对较高，平均单果种子数8.27粒；而野生蓝莓与栽培品种间杂交结实率相对较低，除了野生与‘美登’正反交组合外，野生与其他品种杂交组合平均单果种子数均低于6.00粒，这说明栽培品种间杂交亲和性较强，而野生蓝莓与栽培品种间亲和性相对较弱，如何提高野生蓝莓与栽培品种间亲和性还有待进一步研究。此外，‘北蓝’与‘黑珍珠’正反交结实率在栽培品种杂交组合中达到最高，分别为50.00%和42.86%；野生与‘美登’间正反交结实率在野生与栽培品种杂交组合中也达到最高，分别为17.51%和10.22%，这从另一侧面暗示，在倍性相同基础上，相同植株类型间(同是半高丛或矮丛)杂交亲和性更强，并且同一杂交组合中正、反交的亲和性也存在较大差异。因此，今后开展蓝莓种间杂交育种工作时，既要考虑植株类型的搭配，又要考虑正反交组合的设计，才能从中筛选出亲和性更强的杂交组合，从而提高杂种结实率和种子质量。

蓝莓种子具有较强的休眠特性，且体积微小，直播发芽率低，不易成活[10]。刘肖等[5]使用400 mg·L-1赤霉素浸泡杂交种子24 h后播种，种子发芽率为41%，且耗时长；王光野等[11]先后用35%盐酸、200 mg·L-1赤霉素溶液处理蓝莓种子，发芽率仅为15%；孙书伟等[12]采用组培方法对蓝莓种子进行萌发试验，种子发芽率最高达16.9%。本研究利用组培方法对不同杂交组合的蓝莓种子进行无菌萌发，各组合杂交种子的出芽率均达到66.67%，且萌芽时间短，接种24 d内平均出芽率达82.88%，很大程度上克服了蓝莓种子出芽率低、耗时长的障碍，解决了蓝莓育苗的技术难题。因此，本研究不仅为蓝莓杂交新品种的培育奠定了基础，而且对其他休眠种子的研究也有一定借鉴意义。

[1]方仲相,胡君艳,江波,等.蓝莓研究进展[J].浙江农林大学学报,2013,30(4):599-606.

[2]王国平,宋传玲.大兴安岭野生浆果发展现状与对策[J].内蒙古农业科技,2011(3):122.

[3]顾姻,贺善安.蓝莓浆果与蔓越橘[M].北京:中国农业出版社,2001:1-6.

[4]王慧亮,张慧琴,肖金平,等.蓝莓育种研究概况[J].浙江农业科学,2010(3):441-443.

[5]刘肖,苏淑钗,何智霞，等.蓝莓人工杂交及幼苗培育技术研究[J].中国农学通报,2012,28(34):263-267.

[6]李东斌.大兴安岭高寒地区越桔、笃斯越橘培育技术研究[D].北京：中国林业科学研究院,2005.

[7]欧阳彤,姜彦成,栾启福，等.新疆野生郁金香与栽培品种的杂交性状[J].植物学通报2008,25(6):656-664.

[8]张非亚,杜运鹏,袁晓娜，等.月季远缘和品种间杂交亲本的选择[J].东北林业大学学报,2015,43(4):24-30.

[9]雷家军,代汉萍,葛会波,等.草莓六倍体种间杂种及其回交研究[J].园艺学报,2004,31(4):496-498.

[10]陈镇.高丛蓝莓组培体系及种子萌发率的建模研究[D].金华:浙江师范大学,2011.

[11]王光野,曹高品,韩丽娟.低灌蓝莓(Vaccinumangustifolium)种子萌发温度条件及促进措施试验[J].长春师范学院学报,2013,32(6):73-74.

[12]孙书伟,姚平.蓝莓种子组织培养技术的研究[J].辽东学院学报(自然科学版),2014,21(4):269-271.

Intervarietal Crosses and Hybrid Seedlings Aseptic Germination of Blueberry//

Zhen Cheng, Li Shujuan

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Zhang Yushuang, Yan Shanchun(Northeast Forestry University); Sun Xiaohuan, Xu Yanling, Zhang Yakui(Forestry and Agriculture of Academy in the Daxing’an Mountains)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(1)：52-55.

In order to cultivate blueberry hybrid varieties for the cold situation in northern area, we selected Blomidon, Northblue, Blackpearl andVacciniumuliginosumas parents to perform the intervarietal crosses, and studied the fruit setting rate, fruit weight, thousand-grain weight and budding rate of the hybrid seedlings. Compared with the natural pollination, we evaluated the cross affinity of different blueberry cultivars. Fruit and hybrid seeds can be got from different interspecific hybridization of blueberries, but the fruit setting rate and fruit seeds were lower than those of control. The cross affinity of cultivars was better than that of wild blueberry and cultivars. The fruit setting rate of cultivars was 31.92%, and those of ‘Northblue×Blackpearl’ and ‘Blackpearl×Northblue’ were up to 42.86% and 50.03%, respectively, while the cultivars and wild blueberry was only 7.32%. The cross affinity of the same plant type fit well under the same ploidy. For 24-d cultivation, the budding rate was up to 82.88% on average by 100 μg·g-1GA3. The budding rate of ‘Blackpearl×Blomidon’ was up to 100%.

Blueberry; Intervarietal crosses; Hybrid seeds; Aseptic germination

甄成，女，1990年11月生，林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，硕士研究生。E-mail:13054298510@163.com。

李淑娟，林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学), 高级工程师。E-mail:lishujuan@126.com。

2015年7月23日。

S334.2+5

1)林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)创新项目(2015B03)、大兴安岭行署科技局博士后项目 (2012A02)。

责任编辑：任俐。