谢留杰，段 敏，曾国应，黄善军，潘晓飚*

（浙江省台州市农业科学研究院，台州317000；2湖南亚华种业科学研究院，长沙410000）

两系法杂交水稻育种技术开创了另一条杂种优势利用的途径，并正逐步取代三系法成为生产上应用最广泛的杂种优势利用技术［1-2］。水稻杂交制种是通过雄性不育系与恢复系异交生产种子的技术，制种产量直接关系到不育系的利用价值及配制组合的推广前景［3］。不育系的异交特性是指在非人工条件下植株特性、花器官构造、开花习性等影响接受外源花粉而受精结实的能力。前人对两用核不育系的异交特性开展了大量研究［4-7］，一般都认为柱头外露率和午前开花比率是影响异交结实率的重要指标。但是，影响异交结实率的因子纷繁复杂，除去气候环境的外在因素，不育系的内在因素之间存在相互影响、相互制约的关系。为了准确掌握影响异交结实率的规律，需要全面系统地分析所有异交相关的性状。

本研究对8个籼稻两用核不育系的花器性状和异交特性进行研究，并进行相关性状与异交结实率的统计分析，旨在探索影响异交结实率的关键因子，为高异交率不育系选育和高产制种提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为8个籼稻两用核不育系水稻［8］，包括4个早籼型：湘陵628S、湘陵750S、株1S、陆18S；4个晚籼型：1892S、Y58S、深08S、培矮64S；制种父本为晚籼稻ST500。

1.2 试验方法

1.2.1 柱头活力鉴定

试验于2017年秋季在台州市农业科学研究院试验基地开展。不育系齐穗后，每个不育系一次性选取24个穗并进行剪颖，每穗单独用牛皮纸套袋。剪颖当天开始，每天各不育系分别选取3个剪颖套袋的单穗进行充分授粉，连续进行8 d，授粉后的第20天分别调查各穗结实率。为排除天气因素的干扰，试验在天气晴朗的9月5日和6日进行剪颖，随后每天上午9：30左右取穗，浸水后夹在书中，使稻穗集中开花，母本授粉充足。

柱头活力系数（Stigma activity coefficient，SAC）＝第2天至第4天授粉结实率之和/第2天授粉结实率。

1.2.2 柱头长度、宽度、面积测量

选取发育完整的颖花3枚（6个柱头），放置于血球计数板上，在显微镜下拍摄柱头图片。以血球计数板刻度为标尺，利用ImageJ软件测量柱头长度（Stigma length，SL）、宽度（Stigma wide，SW）和面积（Stigma area，SA）。

1.2.3 开颖角度、开颖时间和柱头外露率调查

挑选10朵颖花，用量角器测量颖花张开角度（Glume opening angle，GOA），同时记录颖花张开持续时间，即开颖时间（Glume opening time，GOT）。

始花期选择5个主穗，每日调查柱头外露颖花数以及开花总数，截止开花结束，统计柱头外露率（Stigma exsertion rate，SER）。

1.2.4 午前开花率（Flowering rate before noon，FRBN）

在晴朗天气下，每个不育系选择5穗，上午开花时每隔1 h记录一次开花数目，直至开花结束，统计12：00之前开花颖数占当天总开花颖数的比例。

1.2.5 不育系制种条件下异交结实率调查

对供试的8份材料进行分期播种，父本ST500在5月30日播种，依据制种父本材料的花期，选出花期相同的不育系材料，移至制种田中。人工赶粉，结束20 d后调查异交结实率（Out crossing rate，OR）。

1.2.6 数据分析

采用Excel 2007进行数据整理，采用SPSS 19.0进行相关性分析和通径分析。

2 结果与分析

2.1 8个籼稻两用核不育系的柱头活力表现

如表1所示，从授粉第2天开始，随着授粉日期的延迟，8个籼稻两用核不育系的结实率均出现明显下降。第7天授粉后，1892S结实率最高达3.13%，陆18S和深08S次之。不育系湘陵750S出现第2天（63.22%）授粉结实率高于第1天（48.63%）现象，可能是剪颖当天某些底部较嫩未能开花，柱头被花药包住降低了结实率。考虑第1天的结实率受到柱头活力之外的因素影响，本研究将第2天的结实率作为柱头活力系数计算的参照。柱头活力系数分析结果表明，供试的不育系柱头活力在1.92—2.44，陆18S和1892S柱头活力系数最高，湘陵628S柱头活力系数最低。异交结实率表现最好的是1892S，达到48.49%，其次是深08S（37.21%）和培矮64S（35.54%），而株1S、湘陵628S、湘陵750S和陆18S的异交率相对较低，不超过30%。供试材料中，晚籼型不育系的异交结实率明显高于早籼型。

综合分析不同天数的结实率、柱头活力和异交结实率发现，1892S和深08S的柱头活力系数属于相对中上水平，在参试水稻不育系中异交结实率较高；柱头活力最低的两个水稻不育系是湘陵628和Y58S，但其异交结实率表现并非最差。从上述结果看出，水稻两用核不育系的异交结实率与柱头活力之间无明显因果关系，柱头活力系数的变异范围不大，该性状对异交结实率的影响有限。

表1 水稻不育系柱头活力系数及异交结实率Table1 Stigma activity coefficient and out crossing rate of 8 rice sterile lines

2.2 籼稻两用核不育系的柱头形态特征

如表2所示，株1S、1892S和深08S的柱头长度较大，分别为1.80 mm、1.42 mm和1.38 mm；陆18S和Y58S柱头较短，分别为0.98 mm和0.95 mm。供试的8个水稻不育系柱头宽、柱头面积与柱头长呈现出相同的趋势，即株1S＞1892S＞深08S＞湘陵628S＞培矮64S＞湘陵750S＞陆18S＞Y58S。株1S的柱头性状明显优于其他不育系，差异达到极显著水平。

表2 水稻不育系的柱头性状Table 2 Stigma traits of 8 rice sterile lines

2.3 籼稻两用核不育系异交结实率和花器官特性、开花习性的相关性分析

从表3可以看出，与异交结实率相关性系数最高的是开颖时间，达到极显著水平（0.839**）；柱头总外露率与异交结实率的相关性也达显著水平（0.744*）。其他性状与异交结实率的相关系数均未达到显著水平。柱头活力一直被看作是影响异交结实率的重要因子，本研究中参试品系柱头活力的变异范围在1.92—2.44。不育系之间差异不大，柱头活力和异交结实率呈现出不显著的关系。

表3 水稻不育系花器官性状与异交结实率的相关性系数Table 3 Correlation coefficient between floral organ traits and outcrossing rate of 8 rice sterile lines

此外，柱头外露率和开颖时间的相关性也达到了显著水平（0.728*），考虑到异交结实率受到开颖时间和柱头外露率的影响，进一步对异交结实率与这2个性状进行偏相关分析。结果显示，异交结实率与开颖时间的偏相关系数为0.640，与柱头外露率的偏相关系数为0.383。根据偏相关分析结果，水稻两用核不育系的开颖时间和柱头外露率是影响异交结实率的2个重要性状，其中开颖时间比柱头外露率与异交结实率的相关性更为密切。

2.4 籼稻两用核不育系异交结实率的回归方程及通径分析

本试验供试材料n＝8，属于小项目样本。利用SPSS 19.0软件，选择Shapiro-Wilk对异交结实率进行正态性检验，结果显示：异交结实率（因变量）统计量为0.858，显著水平P为0.114，大于0.05。因变量异交结实率（y）分布接近正态分布，可以用于回归分析。

利用回归分析的线性方法分析，选择开颖时间（x1）、柱头外露率（x2）、柱头长（x3）、开颖角度（x4）、柱头活力系数（x5）正向相关性状为自变量，建立的模型的相关系数R、决策系数R2分别为0.926、0.858。因此，该模型能够较为全面地考虑到因变量的作用因子。异交结实率的回归方程为：y＝-53.709+0.269x1+0.137x2+10.241x3+0.730x4+5.060x5。

依据通径分析的结果，异交结实率与开颖时间的直接通径系数高达0.662，通过其他性状影响异交结实率的间接通径系数为0.254；与柱头外露率的直接通径系数仅为0.182，通过其他性状影响异交结实率的间接通径系数为0.571；与柱头长度的直接通径系数为0.291，间接通径系数为-0.061；与开颖角度的直接通径系数为0.270，间接通径系数为0.216；与柱头活力系数的直接通径系数为0.099，间接通径系数为0.237，且通过开颖时间的间接系数为0.482。综合所有性状可以得出，水稻两用核不育系影响异交结实率的主要因素为开颖时间和柱头外露率，柱头外露率的间接通径系数的0.482是开颖时间的贡献；其他性状如柱头长度和开颖角度的优化，也可以提高异交结实率；柱头活力对异交结实率的影响不显著。

3 讨论

杂交水稻种子生产中，花器官的构造及开花特性直接决定制种产量的高低。研究表明，水稻不育系的柱头外露率、柱头长度直接影响异交结实率的高低［5，8-10］；关于午前开花率与异交结实率，有研究报道存在显著相关，也有研究表明两者之间并无直接联系［11-12］；柱头活力与异交结实率没有必然关系［5］。本研究通过对包括开颖时间在内的8个性状进行相关分析，结果表明：柱头外露率与异交结实率存在显著的相关性；开颖时间与异交结实率相关性达到了极显著水平，偏相关系数达到0.640，远高于柱头外露率的0.383。通径分析表明，开颖时间对于异交结实率的直接通径系数高于柱头外露率。目前，关于开颖时间与异交结实率相关性的研究较少，一般认为开颖时间越长，异交结实率越高，但没有被作为影响异交结实率的主要因子。本研究表明，在高异交率的水稻不育系选育中，需提高柱头外露率，同时要适当延长开颖时间。供试的8个籼稻不育系中，4个早籼型不育系的异交结实率明显低于晚籼型，原因可能是开颖时间相对较短。

本研究中有2个性状与异交结实率相关系数为负值，柱头宽度与异交结实率相关系数为-0.15，这与前人研究［13］及常规推理存在矛盾。不育系株1S和湘陵750S的柱头宽度最大为0.64和0.47，这2个不育系属于早籼型，其开颖时间不长、柱头外露率不高，在这2个关键因子的作用下使得最后与异交相关系数为负值。午前开花率亦是如此，它与异交结实率也存在负相关（-0.075），主要原因也是早籼型的午前花率相对较高，而其异交结实率比晚籼型低。此外，几个早籼型不育系开花时间较早，开花最早的湘陵628S早上8：00之前有11.89%开花［6］，其开颖时间又相对较短，在父本开花之前，已经有部分颖花闭合，最终导致异交结实率不高。从4个早籼型不育系比较来看，开颖时间和柱头外露率处于同等水平，株1S的柱头长、宽度最高，其异交结实率也最大。本研究中的8个水稻不育系是生产上应用较为广泛的不育系类型，午前开花时间均较早（超过83%），品系之间的差异不明显，得出的结论可能存在局限性。

李维明等［14］研究表明，柱头相关的性状大都具备遗传力较高的特性，并且柱头外露率、开颖时间等性状优良的资源比较丰富，可以通过遗传改良来提升水稻不育系的异交特性。结合本研究的结果，笔者认为籼稻两用核不育系选育过程中，重点关注开颖时间和柱头外露率2个重要指标的选择；其次，柱头长度、开颖角度以及柱头活力等指标也应当进一步优化。同时，在制种环节上要合理安排花期，通过割叶、人工赶粉、喷施赤霉素等措施，充分发挥籼稻两用核不育系的高产制种潜力。