李铭臻 赵文忠 朱志勇 顾 恒 周冰燚 郑立新

广东省计划生育专科医院(广州，510600)

广东省免费孕前优生健康检查地中海贫血基因检测结果分析

李铭臻 赵文忠 朱志勇 顾 恒 周冰燚 郑立新*

广东省计划生育专科医院(广州，510600)

目的：分析近两年广东省免费孕前优生健康检查地中海贫血基因检测结果，为地中海贫血防控工作提供依据。方法：以广东省各县区参加免费孕前优生健康检查的新婚夫妇为研究对象，MCV≤82 fl或(且)MCH≤27pg作为地中海贫血筛查阳性指标，夫妇双方筛查均为阳性时，需同时进行α及β地中海贫血基因检测。结果：16240例筛查阳性者中发现基因携带者12995例(80.0%)准确率为80.0%，部分县区>90%。发现3382对夫妇有妊娠重型地中海贫血胎儿的可能，产前诊断的需求率为41.65%。结论：MCV联合MCH作为筛查地中海贫血阳性指标可靠，操作简单，便于在基层应用，但需加强实验室质量控制。

地中海贫血；筛查；准确性；防控

地中海贫血(简称地贫)是由于α和(或)β珠蛋白基因发生突变或缺失，使得血红蛋白中一种或几种珠蛋白肽链不能合成或合成速率降低，导致血红蛋白中珠蛋白链生成失去平衡，而造成的溶血性贫血[1]。地贫有明显的地域、人群差异，多见于地中海、非洲、东南亚等地区，广东省是我国地贫高发的省份之一[2]。本病重型患者目前尚无法根治，通过血液学的筛查、地贫基因诊断，对同型地贫的高风险夫妇进行产前诊断，淘汰重型胎儿，是目前预防本病最有效的方法[3]。2012年起，广东省在全省范围内进行地贫防控工作，已初步取得显著成效。本研究对相关资料进行分析，为防控提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2012年11月～2014年12月，参加广东省各县区、街道(镇)婚育学校学习的育龄夫妇。对育龄夫妇进行免费孕前优生健康检查，发现夫妇地贫筛查结果均为阳性后，进行地中海贫血基因检测。以筛查阳性16240人(8120对夫妇)作为研究对象。

1.2 方法

1.2.1 地贫筛查 由广东省各县区计划生育服务站、当地医院进行。各检测机构按技术规范的要求，用全自动血细胞分析仪对血液样本进行测定。实验室每天进行室内质量控制，每年全省进行2～4次的室间质量控制。以MCV≤82 fl或(且)MCH≤27pg作为地贫筛查阳性指标。当夫妇双方地贫筛查均为阳性时，将该夫妇血样通过快递形式邮寄到广东省计划生育专科医院进行地贫基因检测。

1.2.2 血样邮寄 由潮州凯普生物化学有限公司提供地中海贫血筛查血样本采集卡(简称采集卡)。各筛查机构将地贫筛查阳性的血样滴进采集卡，自然风干，分别装进专用密封袋后快递到广东省计划生育专科医院优生技术中心。收到快递后，中心先检查装有采集卡的密封袋是否完好，血斑是否合符要求、有无发霉等异常情况。对不符合检测要求的血样，要求当地重新寄送标本；合格的血样同时进行α及β地贫基因检测。

1.2.3 地贫基因检测 DNA提取、α和β地贫基因扩增、反向斑点杂交以及杂交膜条显色均使用潮州凯普生物化学有限公司提供的血液基因组DNA提取试剂盒及α-和β-地中海贫血基因检测试剂盒，(国食药监械(准)字2012第3400399号)，严格按说明书上的步骤、条件进行实验。主要步骤为：①DNA提取，将采集卡上的血斑剪下，用血液基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取；②α地贫基因扩增，DNA样本6ul，反应总体系45ul按以下程序进行扩增：95℃，15min后进入35个循环：98℃，40sec；64℃，70sec；72℃，150sec；72℃，5min；4℃保存；③β地贫基因扩增，DNA样本3ul，反应总体系50ul按以下程序进行扩增：37℃，5min ；94℃，3min后进入40个循环：94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，30sec；72℃，5min；4℃保存；④杂交、显色，用试剂盒内配套的试剂进行实验。在导流杂交仪中放置好地贫基因反向斑点杂交膜条后，加入经过变性的α地贫和β地贫PCR产物，进行杂交、显色。全过程均在导流杂交仪中进行，显色后的杂交膜条晾干后可长期保存。

1.3 地贫基因检测结果判读

地贫基因反向斑点杂交膜条设3个α和6个β正常对照点，可同时检测3种α地贫缺失型基因(SEA、3.7、4.2)、3种突变型基因(CS、QS、WS)及15种常见β地贫突变型基因。每次实验所有正常对照点均应显色，突变纯合子及缺失纯合子除外，否则需重新进行全部实验，从提取DNA进行PCR到杂交、显色。图1为杂交膜条上各杂交位点对应图，出现地贫基因突变、缺失时在相应位置会出现杂交信号。图2-5为不同类型地贫基因携带者的杂交膜条扫描图，依次分别为α地贫3.7缺失杂合子、β地贫41-42突变杂合子、α地贫3.7缺失纯合子以及α地贫WS突变复合β地贫41-42突变杂合子。

1.4 统计学分析

资料采用SPSS 19.0统计学软件进行分析。描述性统计用地贫筛查的准确率(基因检测阳性/初筛阳性)和可能妊娠重型地贫儿的百分比。方差分析比较地贫基因携带者与非地贫基因携带者MCV、MCH水平，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 地贫筛查及基因检测结果

16240例地贫筛查阳性者中，发现12995例地贫基因携带者，占80.0%。α地贫基因携带9224例，占基因阳性者的80.0%，β地贫基因携带4419例，占34.0%，其中 648例α复合β地贫基因携带，占5.0%。地贫基因携带者中，MCV≤82 fl且MCH≤27pg的12564例，占96.7%；MCV≤82 fl，MCH>27pg的85例，占0.7%；MCV>82 fl，MCH≤27pg的346例，占2.7%。

2.2 各县区检测准确率

全省121个县区中持续送检的80个，其中送检标本量超过300例的县区共有15个，分别计算其地贫筛查准确率(地贫基因携带例数/送检总数)，按准确率从高到低排序，结果如表1所示。16240例送检对象的MCV、MCH分别为70.45±6.61 fl，22.76±3.01 pg。比较地贫组和非地贫组MCV和MCH水平，地贫组的MCV和MCH均比非地贫组低(P<0.001)。

表1 送检标本量>300例的县区准确率统计表

表2 16240名调查对象MCV和MCH水平

2.3 重型地贫儿妊娠概率

8120对夫妇中有3382对夫妇可能妊娠重型地贫儿(41.65%)，其中可能妊娠巴氏水肿胎2705对，占79.98%；可能妊娠重型β地贫660对，占19.52%；可能妊娠巴氏水肿胎或重型β地贫17对，占0.50%。产前诊断需求为41.65%。

3 讨论

3.1 MCV联合MCH筛查地贫便于基层，实验室质量控制需加强

广东省是我国地贫的高发省份之一，以往资料显示广东省α地贫基因携带率为8.30%～8.85%[4-5]，β地贫基因携带率为3.36%～3.73%[2，6]。地贫的筛查方法多样，有红细胞脆性一管法、血红蛋白电泳等，经过多年的验证，MCV、MCH联合筛查能提高地贫检测的灵敏度[3，7]。近两年在全省地贫防控工作中，以MCV≤82 fl或(且)MCH≤27pg联合作为地贫筛查阳性的指标，以降低漏诊率。本次全省地贫筛查阳性筛查率为80.0%，部分县区>90%，可见以MCV及MCH作为地中海贫血筛查的阳性指标是简单而且可靠的，便于在基层推广应用。在12995例地贫基因携带者中，MCV≤82 fl且MCH≤27pg 12564例，MCV≤82 fl，MCH>27pg的346例；MCV>82 fl，MCH≤27pg的85例，即只有一项筛查指标阳性的431例，占3.32%(431/12995)。所以MCV、MCH联合筛查有助于提高地贫筛查的灵敏度，降低漏诊率。

在送检标本量>300例的15个县区中，筛查准确率最高的达94.23%，而最低的只有53.86%，存在明显的差距。因此，实验室质量控制必须定期进行。开展实验室室间质量控制，可促进各实验室检测质量和水平的提升[8]。加强实验室室间质量控制后，MCV联合MCH作为地中海贫血筛查阳性指标的准确率有望得到进一步提高，对减少地贫基因检测费用的投入，地贫的研究均有重大意义。

3.2 地贫防控工作任务艰巨，必须加大防控力度

根据孟德尔遗传定律，夫妇双方α地贫基因中同时携带--SEA时，有1/4的机会妊娠巴氏水肿胎；同为β地贫突变基因携带时妊娠重型β地贫儿的概率为1/4；而双方均为--SEA携带复合β地贫时妊娠重型地贫儿的概率为7/16。可能妊娠巴氏水肿胎的有2705对夫妇；可能妊娠重型β地贫儿的有660对；两者均有可能的有17对。上述合计3382对夫妇有必要进行产前诊断，避免重型地贫儿的出生，尤其是重型β地贫儿。夫妇双方地贫筛查均为阳性后，产前诊断的需求率为41.65%。其中可能妊娠巴氏水肿胎的占大多数(80%)，这与广东人群α地贫基因携带率高于β地贫基因携带有关[2-6]。

市级医院陆续开展地贫基因检测项目，其下属县区的地贫基因检测可于当地进行。全省121个县区近两年有持续送标本至本中心检测的有80个，所以全省妊娠重型地贫儿的可能数目将超过上述数字。若地贫基因携带的夫妇从优生角度考虑，血红蛋白H病等中间型地贫胎儿也进行淘汰，产前诊断的需求率将更高。2010年第六次全国人口普查的数据显示，广东省已成为全国人口数量第一大省，人群数量庞大，地贫携带率高。广东省进行地贫防控已有多年，已取得初步成效及经验，但防控工作任务依然艰巨，需继续加大防控力度。

[1] 茅矛,杜传书,王箐,等.地中海贫血的红细胞抗氧化酶和核苷酸代谢酶活性变化[J].中国病理生理杂志,1994,10(6):477-481.

[2] Xu X,Liao C, Liu Z,et al. Antenatal screening and fetal diagnosis of beta-thalassemia in a Chinese population:prevalence of the beta-thalassemia trait in the Guangzhou area of China [J] . Human Genetics 1996, 98(2):199-202.

[3] 李铭臻,潘干华,周冰燚,等. β地中海贫血筛查中MCV可靠性的分析[J].中国优生与遗传杂志,2014,22(5):22-23.

[4] 肖维威,徐湘民，徐钤.中国人缺失型α-地中海贫血的分子基础及产前基因诊断[J].第一军大大学学报,1998,18(1):68-72.

[5] 申芫子,李哲刚,潘干华,等. 广东省佛山市新婚育龄人群α地中海贫血的分子流行病学调查[J]. 中国计划生育学杂志,2010,18(1):31-32.

[6] 申芫子,李哲刚,潘干华,等. 广东省佛山市育龄人群β地中海贫血的分子流行病学调查[J]. 中国计划生育学杂志,2010,18(3):160-162.

[7] 梁栋伟,李荣川,何健,等. MCV、MCH检测在地中海贫血筛查中的应用研究[J].国际检验医学杂志,2014,35(8):960-961.

[8] 杨永俊,李铭,陈丹,等. 河南省计划生育系统临床实验室室间质量评价资料分析[J]. 中国计划生育学杂志,2013,21(4):249-250.

[责任编辑：董 琳]

Analysis of results of thalassemia genes testing in project of free pre-pregnancy aristogenesis detecting of Guangdong province

LI Mingzhen, ZHAO Wenzhong, ZHU Zhiyong, GU Heng, ZHOU Bingyi, ZHENG Lixin*

FamilyPlanningSpecialHospitalofGuangdong,Guangdong, 510600

*Correspondingauthor：ZhengLixin，Email:605512183@qq.com

Objective: To analyze thalassemia gene detecting results in nearly two years of free pre-pregnancy eugenics health examination of Guangdong province, and to provide evidences for preventing and controlling halassemiathe. Method: Newly married couples who attended the free pre-pregnancy health care of Guangdong were recruited. MCV≤82 fl or (and) MCH≤27 pg was positive indicators for thalassemia screening . When the screening results of both husband and wife were positive, α and β thalassemia gene was detected subsequently. Result: In the 16240 cases whose thalassemia screening results were positive, 12995 cases were diagnosed as thalassemia gene carriers. According to the statistics, the accuracy rate of thalassemia screening was 80.02% in Guangdong province, and accuracy rate were even more than 90% in some counties. At the same time, 3382 couples had fetus with risk of severe thalassemia, so 41.65% couples needed to recieve prenatal diagnosis. Conclusion: MCV combining with MCH as the positive indicator for thalassemia screening is reliable. And it is easy to be used in the grass-root service setting because of simpleness for operation. However, laboratory quality control should be strengthened. The prevention and controlling thalassemia should be strengthened as it is a hard work.

Thalassemia; Screen; Accuracy; Prevention and controlling

广东省人口计生委基金项目(20132035)

2015-03-10

2016-05-19

10.3969/j.issn.1004-8189. 2016.07

*通讯作者：605512183@qq.com