刘　静　邓　晶　陈扬凯　腾　青　徐秀章　邵　媛　王嘉励　夏文杰　叶　欣

广州血液中心临床输血研究所 (广州 510095)



ITP患者血清IgG型抗体糖基化特异性的研究

刘静邓晶陈扬凯腾青徐秀章邵媛王嘉励夏文杰叶欣

广州血液中心临床输血研究所 (广州 510095)

【摘要】目的分析ITP患者血清中IgG型抗体糖基化的特异性，初步探讨其特异性与临床症状的相关性。方法选取健康献血员30例、ITP患者13例及健康怀孕妇女23例，纯化血清中的IgG型抗体，应用nano-LC-MS法分析糖基化种类及水平，对比分析ITP患者血清中IgG型抗体的糖基化特异性。 结果① ITP 患者血清中IgG型抗体的半乳糖糖基化水平为47.08±2.69，低于健康怀孕妇女(50.93±2.21)，高于健康献血员(42.88±2.00)(P<0.05)；② ITP 患者岩藻糖基化水平为81.16±2.49低于健康献血员(82.60±2.56)(P>0.05)，同时低于健康怀孕妇女(86.17±2.23)(P<0.05)；③ITP 患者唾液酸化水平为3.93±1.20，高于健康献血员(3.69±1.19)，低于健康怀孕妇女(4.28±0.88)(P>0.05)。④ITP 患者乙酰葡糖氨基化水平为10.53±1.41，低于健康献血员(11.54±1.76)，高于健康怀孕妇女(10.13±1.45)(P>0.05)。 结论ITP患者血清中的IgG型抗体的岩藻糖基化、半乳糖糖基化水平的特异性可能是其产生有别于健康怀孕妇女的临床症状的的分子基础。

【关键词】ITPIgG型抗体糖基化

免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenic, ITP) 是一种获得性的自身免疫型疾病，临床上主要表现为皮肤、黏膜瘀斑、出血，严重时可能出现内脏出血甚至颅内出血。患者血清中含有抗血小板的抗体，尤其是病程凶险的慢性ITP患者血清中主要存在的抗体是IgG1型(77%)[1]。IgG是血清中含量最多的免疫球蛋白 (约占80%)，其Fc段含有唯一的N-糖基化修饰保守位点，即Asn-297。由于连接在Asn-297核心七糖上的糖链末端的糖基不同，IgG存在着种属、组织、年龄和性别的特异性。连接在Asn-297上的糖链可维持IgG抗体的四级结构以及Fc段的热稳定性，并通过影响IgG分子与FcRsXlq以及FcRn的结合而分别调节抗体依赖细胞毒作用(ADCC)、补体依赖的细胞毒作用(CDC)以及抗体的半衰期，从而导致患者出现血小板减少、免疫力降低及皮肤、黏膜或内脏出血等临床症状[2-5]。

ITP的主要发病机制为患者血清中存在的IgG 型抗体可介导产生相应的临床病症，而部分健康人群及健康的怀孕妇女血清中也存在IgG抗体，却并不会产生与ITP患者相似的临床症状。这可能与ITP患者产生的抗体Fc段的N-糖基化的保守位点的糖基的特异性有关。故本实验通过纯化ITP患者与健康人群及健康怀孕妇女血清中的IgG型抗体，检测其糖基化的特异性，并将三者进行比较，寻找ITP患者血清中抗体糖基化的特异性与其临床症状的相关性。

1资料与方法

1.1研究对象随机选取2007年—2013年广州血液中心采集的30份健康献血员、23份健康怀孕妇女及13份临床诊断为ITP的患者血清标本。本研究遵循的程序符合广州血液中心人体试验委员会所制定的伦理学标准，得到该伦理会批准，试验征得受试对象本人的知情同意，并与之签订临床研究知情同意书。

1.2主要试剂和仪器ProtG-sepharose 磁珠 (GE Healthcare 17-0618-05)，formic acid(94318-250 mL-F Fluka analytical)，Acetic acid (glacial) CH3COOH (EMSURE-K44691363326)，NH4HCO3(FlukaBioChemika-09830 500 gr)，Trypsin(Promega Cat # V5111)。压力真空泵，平板摇床，真空离心浓缩系统，质谱仪。

1.3方法nano-LC-MS法

1.3.1从血清中纯化IgG型抗体。将洗涤后的30 μl Protein G- Sepharose 磁珠和2 μl血清混匀，孵育1小时，吸附血清中的抗体。PBS、去离子水分别洗涤三次，100 μl甲酸将抗体洗脱，真空离心浓缩系统中离心3小时，获得纯化的抗体。

1.3.2使用胰蛋白酶消化抗体，获得抗体的Fc段。纯化获取的抗体加入20 μl NH4HCO3在摇床上孵育10分钟，后加入20 μl稀释后的胰蛋白酶，于摇床上孵育10分钟，随机选取3- 4个检测孔检测其pH值，确保pH>6(若<6，可用NH4HCO3调整)。将反应板密封，37℃孵育过夜。

1.3.3将检测孔稀释10倍，上机检测。

1.4统计分析使用SPSS 17.0统计软件对数据进行处理，组间采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

ITP 患者血清中IgG型抗体的半乳糖糖基化水平为(47.08±2.69)，低于健康怀孕妇女(50.93±2.21)，高于健康献血员(42.88±2.00)，该差异有统计学意义，见图A；岩藻糖基化水平为(81.16±2.49)，低于健康献血员(82.60±2.56)，该差异无统计学意义，与健康怀孕妇女(86.17±2.23)相比有统计学差异(P<0.05).见图B；唾液酸化水平为(3.93±1.20)，高于健康献血员(3.69±1.19)，低于健康怀孕妇女(4.28±0.88)，此差异无统计学意义，见图C；乙酰葡糖氨基化水平为(10.53±1.41)，低于健康献血员(11.54±1.76)，高于健康怀孕妇女(10.13±1.45)此差异无统计学意义，见图D。

图1血清中IgG型抗体的糖基化水平及种类(A：半乳糖糖基化水平；B：岩藻糖基化水平；C：唾液酸化水平；D：乙酰葡糖氨基化水平。*P<0.05 NSP>0.05)

3讨论

免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenic, ITP) 又称特发性血小板减少性紫癜，是临床上最常见的、原因不明的出血性疾病，是一种获得性的自身免疫型疾病。目前的研究认为ITP的发病机制非常复杂，仍在不断的研究更新中，最重要的是自身抗体介导的血小板的破坏。

ITP患者血清中含有的主要抗体类型是IgG，糖基化是IgG重要的翻译后修饰，末端糖链的不同可产生不同的糖基化，包括半乳糖基化、核心岩藻糖基化、唾液酸化、乙酰葡糖胺基化和甘露糖基化。近年来越来越多的人认为蛋白糖基化修饰在许多疾病中起到非常重要的作用[2- 4]。研究发现不同的糖基化对IgG功能的影响有所不同：①末端半乳糖基化对IgG功能的影响目前尚未达成共识。Kumpel等研究表明半乳糖化水平增高可提高ADCC[5]。 Hodoniczky等[6]却发现提高末端半乳糖基化水平，可增强其CDC的强度，但对ADCC并无影响；②IgG若无核心岩藻糖基化，则其与FcrRⅢa亲和力明显增强，同时ADCC也显著增强[6-8]。③唾液酸糖基化水平越高，抗体与抗原的结合活性和ADCC越低[7]；④糖链末端乙酰葡糖胺基化水平的提高可显著增强IgG的ADCC,但对其CDC和半衰期影响比较小[8]；⑤抗体的甘露糖基化水平升高，其ADCC显著升高，而CDC却减弱；已有研究表明ITP患者血清中的抗体的N-糖基化同样可以影响血小板吞噬和血小板存活时间，并通过影响补体活化调节ADCC的强度[9]。因此，ITP患者血清中抗体的糖基化特异性的研究便十分必要。本实验将ITP患者及健康孕妇和健康献血员血清中抗体的糖基化水平进行比较，发现与健康献血员相比，ITP患者半乳糖基化的水平有明显的增高，但较健康怀孕妇女增高的幅度较小，核心岩藻糖基化的水平有略微下降，而此时怀孕妇女较健康献血员则表现为明显的升高，虽经检验分析后无统计学差异，但考虑是由于样本量不足导致，其间的差异较为明显，推测在扩大样本量之后该差异仍应存在。由此可发现，ITP患者产生的血小板特异性抗体较健康献血员半乳糖基化水平增强，核心岩藻糖基化水平减弱，而较健康怀孕妇女半乳糖基化水平和核心岩藻糖基化水平均增强。该差异可能导致ITP患者与健康的怀孕妇女虽然血清中都产生了IgG型抗体，但ITP患者出现不同程度的血小板减少，皮肤、粘膜或内脏出血等临床症状，而怀孕妇女并无相应临床病症。

参考文献：

[1] MCMILLAN R. The pathogenesis of chronic immune thrombocytopenic purpura[J]. Semin Hematol，2007,44(4 Suppl 5):S3-S11.

[2] WANG J, ZHOU C, ZHANG W, et al. An integrative strategy for quantitative analysis of the N-glycoproteome in complex biological samples[J]. Proteome Sci，2014, 15，12(1):4.

[3] CLERC F, REIDING KR, JANSEN BC, et al. Human plasma protein N-glycosylation[J]. Glycoconj J， 2015, 10.

[4] KAPUR R, DELLA VALLE L, Sonneveld M,et al. Low anti-RhD IgG-Fc-fucosylation in pregnancy: a new variable predicting severity in haemolytic disease of the fetus and newborn[J]. J Rheumatol. Br J Haematol，2014，166(6):936-945.

[5] BRADY LJ, VELAYUDHAN J, VISONE DB, et al. The criticality of high-resolution N-linked carbohydrate assays and detailed characterization of antibody effector function in the context of biosimilar development[J]. MAbs. 2015，7(3):562-570.

[6] HODONICZKY J, Zheng YZ, JAMES DC. Control of recombinant monoclonal antibody effector functions by Fc N-glycan remodeling in vitro[J]. Biotechnol Prog, 2005, 21(6):1644-1652.

[7] ANTHONY RM, NIMMERJAHN F, ASHLINE DJ, et al. Recapitulation of IVIG anti-inflammatory activity with a recombinant IgG Fc[J]. Science, 2008, 320(5874):373-376.

[8] NICOLE SAMUELS, DAVID KATES, JUN LIU, et al. Characterizing the Glycosylation State of Therapeutic Recombinant Glycoproteins[J]. Methods in Molecular Biology, 2012, 951: 323-334.

[9] BAKCHOUL T, WALEK K, KRAUTWURST A, et al. Glycosylation of autoantibodies: insights into the mechanisms of immune thrombocytopenica[J]. Thromb Haemost, 2013, 110(6):1259-1266.

基金项目：广东省医学科研基金项目(B2013344)、广州市医学重点学科建设项目、广州市血液安全重点实验室；广州科技计划应用基础研究计划项目(2010Y1-C471)；广州市医药卫生科技重点项目(20121A021020)

通信作者:叶欣，E-mail:huang_yexin@qq.com

DOI：10.3969/j.issn.1000-8535.2016.02.009

(收稿日期：2015-12-10)

Study on the glycosylation specificity of the IgG antibody in ITP

LiuJing,DengJing,ChenYangkai,etal.

GuangzhouBloodCenterInstituteofBloodTransfusion,Guangzhou510095,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the glycosylation specificity of the IgG antibody in ITP.MethodsChoose 30 healthy donors, 23 healthy pregnants and 13 ITP patients, purified the IgG antibody from serum, analysied the level of all kinds of glycosylation. Compared with healthy donor and healthy pregnants to find the specificity of the IgG antibody in ITP patients.Results① The galacosylation of IgG antibody in ITP patients was 47.08±7.24，lower than healthy pregnants (50.93±4.91), higher than healthy donor (42.88±4.01), and the healthy pregnants were higher than healthy donor (P<0.05). ② The fucosylation in ITP patients was 81.16±6.2， lower than healthy donors (82.60±2.56) (P>0.05), higher than healthy pregnants(86.17±2.23)(P<0.05)； ③The sialylation in ITP patients was 3.93±1.20, higher than healthy donors (3.69±1.19), lower than healthy pregnants (4.28±0.88)(P>0.05); ④The GlcNAc in ITP patients was 10.53±1.41, lower than healthy donors (11.54±1.76), higher than healthy pregnants (10.13±1.45)(P>0.05).Conclusion The specificity of IgG antibody in ITP patients in galacosylation and fucosylation may be the molecule base of ITP’s clinic symptom.

【Key words】Immune thrombocytopenic; IgG antibody; Glycosylation

共同第一作者：刘静，邓晶