何军华，王　丽，吴慧璐，范运娟，王　巍，范　鑫，李　兴



血管紧张素(1-7)对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡的作用

何军华，王丽，吴慧璐，范运娟，王巍，范鑫，李兴

山西医科大学第二医院(太原 030001)

摘要：目的探讨血管紧张素(1-7)[Ang-(1-7)]对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠糖代谢及胰岛β细胞凋亡的影响。方法健康雄性Wistar大鼠给予高脂高热量饲料喂养，8周后腹腔一次性注射STZ(30 mg/kg)，建立2型糖尿病模型大鼠共20只，随机分为糖尿病对照组(D0组)和Ang-(1-7)干预组(D1组)，同时设正常对照组(NC组)。D1组给予Ang-(1-7) 300 μg/(kg·d)皮下注射，余两组注射等体积生理盐水。干预共持续8周，监测空腹血糖(FPG)，检测血清中空腹胰岛素(FINS)及Ang Ⅱ的含量，计算稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)，免疫组化法检测胰岛细胞内iNOS及Caspase-3的蛋白表达，实时荧光定量PCR法检测胰岛iNOS、bax、bcl-2及Caspase-3的mRNA表达。结果与NC组相比，D0组大鼠FPG、AngⅡ及HOMA-IR明显升高，FINS浓度降低，胰腺iNOS、Caspase-3的蛋白表达分别增加了77.1%、1.03倍，iNOS、Bax、Caspase-3的基因表达水平分别增加3.4倍、2.9倍和4.6倍，Bcl-2基因表达降低了74.8%(P<0.05)。与D0组相比，D1组FPG、Ang Ⅱ及HOMA-IR下降，FINS浓度升高，iNOS及Caspase-3蛋白表达分别降低了19.4%、37.2%，iNOS、Bax、Caspase-3的基因表达水平分别降低了67.6%、37.7%和39.7%，Bcl-2基因表达增加了81.2%(P<0.05)。结论Ang-(1-7)可通过降低胰岛局部氧化应激,减少β细胞凋亡而改善STZ诱导的糖尿病大鼠胰岛分泌功能及胰岛素抵抗，发挥抗糖尿病作用。

关键词：糖尿病；大鼠；血管紧张素(1-7)；胰岛功能；细胞凋亡

近年来2型糖尿病与肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system，RAS)的关系备受关注，研究发现RAS阻断剂可降低高危人群的新发糖尿病发生率[1-2]。利用RNA干扰技术阻断血管紧张素转换酶以及利用血管紧张素 Ⅱ(AngiotensinⅡ，Ang Ⅱ受体阻断剂在细胞水平及动物实验中均可以减少氧化应激及细胞凋亡，改善胰腺纤维化，增加胰岛素分泌[3-5]。血管紧张素(1-7) [angiotensin-(1-7)，Ang-(1-7)]是RAS的重要成员之一，主要由Ang Ⅱ在血管紧张素转换酶2的作用下生成，通过与其受体结合发挥扩血管、抗炎、抗组织纤维化、抗氧化应激等效应，与Ang Ⅱ作用相反[6-7]。已有研究表明，Ang-(1-7)可以促进葡萄糖摄取和脂质分解，改善胰岛素抵抗及血脂异常[8]。

本研究即应用高脂高热量饲料喂养结合小剂量STZ腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型，给予Ang-(1-7)干预，观察Ang-(1-7)对糖代谢、胰岛素分泌功能、胰岛素抵抗、氧化应激以及胰岛β细胞凋亡的影响。

1材料与方法

1.1动物模型制备及分组8周龄雄性Wistar大鼠，体重180 g～220 g，由山西医科大学实验动物中心提供。随机选取12只为正常对照(NC)组，普通饲料喂养。24只给予高糖高脂高热量饲料喂养，8周后腹腔一次性注射STZ(30 mg/kg)，一周后非同日两次尾静脉采血测随机血糖≥16.7 mmol/L为成模标准。成模大鼠20只随机分为糖尿病对照组(D0组，n=10)、Ang-(1-7)干预组(D1组，n=10)。D1组以Ang-(1-7) 300 μg/(kg·d)颈部皮下注射，余两组以等量的生理盐水颈部皮下注射，共干预8周。

1.2检测指标实验前后测体重和空腹血糖(FPG)，每日观察动物的食欲、活动力、体温及其他反应情况。 实验结束时ELISA法检测血清Ang Ⅱ和空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)的浓度，计算稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA -IR)，HOMA-IR=空腹胰岛素(mU/L)×空腹血糖(mmol/L)/22.5。

1.3免疫组化检测胰腺iNOS与Caspase-3蛋白表达做胰腺组织石蜡切片，每个大鼠每个指标选5张切片，iNOS与Caspase-3免疫组织化学染色，将每张切片随机编号，在高倍(×400)镜下双盲观察6～8个视野，选择胰岛部分用计算机图像处理系统进行平均光密度值检测，经校正后代表其蛋白的相对表达水平，并量化分析。1.4实时荧光定量PCR提取胰岛β细胞总RNA，检测iNOS、Bax、Bcl-2与Caspase-3的mRNA表达水平。基因扩增反应条件均为：94℃预变性10 min，94℃15 s，60℃60 s，扩增45个循环。引物序列见表1。

表1　引物序列

2结果

2.1Ang-(1-7)对大鼠FPG、体重、Ang Ⅱ、FINS及HOMA-IR的影响(见表2)干预结束后，D0组和D1组大鼠体重差异无统计学意义，但两组体重均低于NC组。与NC组比较，D0组FPG、AngⅡ浓度、HOMA-IR明显升高，FINS明显减少。D1组与D0组相比，FPG、Ang Ⅱ、HOMA-IR降低，FINS增加。提示Ang-(1-7)治疗降低RAS活性，增加血清胰岛素含量，改善胰岛素抵抗，发挥抗糖尿病作用。

表2　干预后各组大鼠FPG、FINS、HOMA-IR、Ang Ⅱ的比较(±s)

2.2免疫组化结果胰岛内iNOS与Caspase-3的表达水平(见图1、表3)与NC组相比，D0组胰岛iNOS相对表达量增加了77.1%，Caspase-3相对表达量增加了1.03倍。与D0组相比，D1组iNOS相对表达量降低了19.4%，Caspase-3相对表达量下降了37.2%。表明经Ang-(1-7)干预后，胰岛内氧化应激降低，促凋亡蛋白表达下降。

图1　胰岛iNOS及Caspase-3免疫组化染色(×400)

表3　各组大鼠胰岛免疫组化结果量化分析(±s)

2.3iNOS、Bax、Bcl-2及Caspase-3的mRNA表达水平(见表4)与NC组相比，D0组iNOS、Bax、Caspase-3的mRNA表达水平分别增加了3.4倍、2.9倍和4.6倍，Bcl-2mRNA表达水平降低了74.8%。与D0组相比，D1组iNOS、Bax、Caspase-3的mRNA表达水平分别降低了67.6%、37.7%和39.7%，Bcl-2mRNA表达水平增加了81.2%。表明经Ang-(1-7)干预后，促β细胞凋亡因子基因表达下降，抗凋亡因子基因表达增加。

表4　胰腺内iNOS、Bax、Bcl-2及Caspase-3的mRNA相对表达量(±s)

3讨论

研究已证实胰腺组织内能表达完整的且具有功能活性的RAS成分，并参与胰岛β细胞功能和存活的调节，与糖尿病时β细胞功能障碍的发生发展密切相关[9]。最新研究表明，胰腺存在RAS的重要成分Ang-(1-7)，可拮抗Ang Ⅱ的作用，Ang-(1-7)参与几乎所有RAS系统的调节机制[10-13]，成为具有很大潜力的RAS干预靶点。

高糖时胰腺局部RAS过度表达，Ang Ⅱ生成增加，诱导胰岛细胞产生过多的活性氧中间产物，一方面可能激活细胞内凋亡通路，诱导细胞凋亡，抑制胰岛素的合成及释放，最终导致胰岛结构和功能损害，另一方面也可直接损害胰岛β细胞[14-15]。本实验也发现糖尿病大鼠血清Ang Ⅱ浓度增加，胰岛局部iNOS及凋亡因子Caspase-3蛋白表达水平升高，同时血清胰岛素浓度下降。通过给予Ang-(1-7)干预后发现，血清Ang Ⅱ浓度降低，胰岛的iNOS及Caspase-3蛋白表达水平均减少，胰岛素分泌增加。

2型糖尿病中胰岛β细胞凋亡的主要信号途径是线粒体途径[16]，即促凋亡因子(如Bax、Bid等)和抗凋亡因子(如Bcl-2、Bcl-xl等)异常表达使线粒体外膜通透性增加，同时内膜里的细胞色素C释放到细胞质，激活Caspase3、Caspase6、Caspase7，破坏细胞的结构和代谢，导致细胞凋亡。研究表明氧化应激是引起β细胞功能缺陷并加剧其恶化的主要原因，活性氧(ROS)类物质是细胞凋亡的重要介质，作用于线粒体凋亡途径的各个环节。ROS既能上调Bax的表达，又能在Caspase级联放大中起到重要作用[17-19]。本实验发现2型糖尿病大鼠经Ang-(1-7)干预后，胰岛中促凋亡因子Bax、Caspase-3基因表达降低，抗凋亡因子Bcl-2基因表达升高，由此可推测糖尿病状态下拮抗RAS后，可通过下调iNOS的表达，降低胰岛局部氧化应激水平，减少β细胞凋亡，对β细胞起到保护作用。

有研究证实在氧化应激时，可导致胰岛素信号通路受阻，引发胰岛素抵抗。研究表明RAS与胰岛素抵抗关系密切，Ang Ⅱ可影响肝脏、肌肉和脂肪组织的胰岛素受体、胰岛素受体底物及葡萄糖转运体4等，激活胰岛素抵抗[20]。本实验用Ang-(1-7)干预后，糖尿病大鼠胰岛素抵抗指数降低，说明阻断RAS可增加胰岛素的敏感性。

STZ诱导的糖尿病大鼠Ang Ⅱ生成增多，胰腺局部氧化应激反应、促凋亡因子表达增加，抗凋亡因子表达下降，胰岛素分泌减少，胰岛素抵抗指数增加。Ang-(1-7)干预可减弱胰腺局部氧化应激反应，改善凋亡系统失衡，改善胰岛素分泌功能及胰岛素抵抗，发挥抗糖尿病作用。

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(本文编辑王雅洁)

基金项目：山西省自然科学基金(No.2009011056-2)；山西省卫生和计划生育委员会科技攻关项目(No.201201074)；山西省高校“131”领军人才工程

通讯作者：李兴，E-mail：13007000339@163.com

中图分类号：R587R285.5

文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.13.015

文章编号：1672-1349(2016)13-1488-04

(收稿日期：2016-05-11)