张冬雷　高　瑛　宋　丹　王　璜　马　兰（天津合美医药科技有限公司　天津　300308）

HPLC手性固定相法拆分阿普斯特对映体

张冬雷高瑛宋丹王璜马兰（天津合美医药科技有限公司天津300308）

目的：建立新的高效液相色谱手性固定相法分离阿普斯特（Apremilast）的一对对映体。考察流动相组成、添加剂种类以及柱温等对阿普斯特对映体分离的影响。方法：采用Chiralpak OJ-H（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；以正己烷-异丙醇（45∶55）为流动相；流速为1.0mL·min-1；检测波长：254nm。结果：阿普斯特的两个对映异构体能得到良好的分离。结论：本方法操作简便，快速，重复性良好，适合阿普斯特的对映体分离及光学纯度的测定。

阿普斯特 HPLC手性固定相 对映体拆分

1引言

阿普斯特（Apremilast）是由美国细胞基因公司开发的具有抗炎作用的PDE4酶抑制剂，2014年3月21日经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于成人活跃型银屑病性关节炎（PsA）的治疗，同年9月23日，被FDA批准用于治疗中度至重度斑块型银屑病（plaque psoriasis），具有广阔的市场前景。根据文献报道，其S型异构体的活性要比R型至少高5倍［1］，因此阿普斯特是以S型进行临床试验并最终上市。美国细胞基因公司的专利中采用安捷伦公司的Ultron Chiral ES-OVS色谱柱分离阿普斯特对映异构体［2］，该色谱柱为蛋白柱，使用条件限制较多，保存条件苛刻，寿命短；蒙发明等改用大赛璐的AS-H色谱柱建立了新的对映体测定方法［3］，并进行了方法学验证，但该色谱柱为大赛璐第一代色谱柱，固定相是涂布在硅胶上，可使用的流动相种类有限，要求高，寿命往往较短。本文使用大赛璐的IA柱开发了新的方法，该色谱柱的固定相为硅胶键合型，较涂布型色谱柱稳定性大大增加，有效解决了上述问题，也给阿普斯特的对映体测定提供了全新的选择。

2材料和方法

2.1实验材料：阿普斯特对照品（自制，批号为20140416，含量99.5%），阿普斯特对映体对照品（自制，20140418，含量99.9%）；正己烷，无水乙醇及异丙醇均为色谱纯试剂（天津康科德科技有限公司）；二乙胺为分析纯试剂（天津光复精细化工研究所）。

2.2仪器：LC-20A型高效液相色谱仪，包括SPD-M20A二极管阵列检测器（岛津公司）。

2.3方法

2.3.1实验色谱条件：色谱柱：Chiralpak IA（4.6mm×250mm，5μm，Daicel Chemical Industries，LTD，日本）；柱温：35℃；流动相：正己烷-异丙醇（45∶55）；流速为：1.0mL·min-1；检测波长：234nm；进样量：20μL。

2.3.2样品的配制：系统适用性溶液的配制：分别取阿普斯特对照品及阿普斯特对映体对照品500.12和10.01mg，置于同1个100mL量瓶中，加适量甲醇溶解后，加流动相稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液1mL，置10mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，可得含阿普斯特0.5001mg·mL-1及其对映体10.01μg· mL-1的溶液，作为系统适应性溶液。

3结果

3.1流动相的选择：Chiralpak IA手性柱是将直链淀粉-三（3，5-二甲苯基氨基甲酸酯）通过共价键键合在硅胶表面制成，样品分子与固定相之间的作用力主要是氢键作用、π-π作用、偶极-偶极作用及立体效应。流动相通常选用烷烃加适量有机改性剂组成。对于弱碱性化合物，在流动相中加入二乙胺或三乙胺呈弱碱性，可使药物离子化程度降低，更容易与固定相发生作用，有利于手性分离；对于弱酸性药物则相反。因此采用正己烷为流动相主体，调节有机改性剂比例，必要时调节酸碱以改善分离。

3.1.1流动相中有机改性剂的种类对对映体保留和分离的影响：本文考察了流动相中分别以相同浓度的乙醇和异丙醇作为有机改性剂时对阿普斯特对映体分离的影响，结果见表1。从表中可见使用乙醇效果较差，异丙醇则可以使阿普斯特的两个对映体得到良好的分离。使用异丙醇时两对映体的保留更强，选择性因子α更好，因此选择异丙醇作为有机改性剂。

表1不同种类的醇对阿普斯特对映体分离的影响

3.1.2流动相中异丙醇的浓度对对映体保留和分离的影响：流动相中异丙醇的浓度对对映体保留和分离的影响见表2。从表中可见，当异丙醇的浓度在50%～60%之间时，两对映体均能得到良好的分离。随着异丙醇浓度增加，容量因子（k1、k2）、分离度（R）明显减小，但选择性因子α几乎不变。流动相中极性成分（异丙醇）与固定相之间形成的氢键作用，抑制对映体与固定相之间的相互作用，可降低手性柱的手性识别能力。因此减少流动相中极性成分使保留时间延长，有利于对映体的分离。异丙醇浓度低于50%时，由于保留时间延长，扩散作用使色谱峰展宽。异丙醇浓度过大，会加大柱压，减少手性柱的使用寿命，综合考虑，选择流动相中异丙醇的浓度为55%。

表2流动相中异丙醇的浓度对阿普斯特对映体色谱参数的影响

3.1.3流动相中酸碱添加剂对对映体分离的影响：阿普斯特分子显中性，理论上酸碱添加剂对对映体的分离作用不大，但考虑到手性分离原理的复杂性，本文也对酸碱添加剂对对映体分离的影响进行研究，结果见表3。从表中可见，酸碱添加剂对阿普斯特和其对映体的分离基本没有影响，因此流动相中不添加酸碱添加剂。

表3流动相中酸碱添加剂对阿普斯特对映体色谱参数的影响

3.1.4柱温对对映体分离的影响：在其他色谱条件一定的情况下，考察了柱温的变化对对映体的k1、k2、α、R的影响，结果见表4。从表中可见，随着温度的升高，对映体的保留减弱，分离度有所下降。有关文献报道，对映体的色谱分离受热力学控制［4］，为焓驱动过程，即柱温越低分离效果越好。在低温时分子的旋转和热动力减弱，使其与手性固定相作用的机会及强度增加，提高了手性识别作用。但过低的柱温会增加流动相的黏度，使色谱系统压力增大。

表4温度对阿普斯特对映体分离的影响

3.2方法的专属性：在上述最佳色谱条件下，取系统适用性溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，在该色谱条件下阿普斯特对映体能够达到完全分离，分离度为3.01，前一个色谱峰为R型异构体。

3.3方法的重复性及检测限：在上述最佳色谱条件下，进样6次，两对映体的保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD）均小于2.0%，说明该方法的重复性良好。将系统适用性溶液进一步稀释，当信噪比（S/N）为3时，测得两对映体的检测限约为15ng。

4讨论

本文建立了高效液相色谱手性固定相法分离阿普斯特对映异构体，同时考察了有机极性调节剂的种类和浓度及柱温等因素对分离的影响。本方法操作简便，快速，重复性良好，为分离阿普斯特对映异构体及测定其光学纯度提供了新的选择。

［1］Hon-Wah Man，Peter Schafer，Lu Min Wong，et al.Discovery of （S）-N-｛2-［1-（3-Ethoxy-4-methoxy-phenyl）-2-methanesulfonylethyl］-1，3-dioxo-2，3-dihydro-1H-isoindol-4-yl｝acetamide （Apremilast），a potent and orally active phosphodiesterase 4 and tumor necrosis factor-α inhibitor［J］.Journal of Medicinal Chemistry，2009，52（6）：1522-1524.

［2］乔治·W·穆勒，彼得·H·谢弗，汉华曼，等.包含（+）-2-［1-（3-乙氧基-4-甲氧基苯基）-2-甲基磺酰基乙基］-4-乙酰基氨基异吲哚啉-1，3-二酮的固体形式、其组合物及其用途.美国.专利申请号：CN200880129462［P］.公开日：2011.05.04.

［3］蒙发明.HPLC法测定阿普斯特对映异构体［J］.化工中间体，2015（3）：37-38.

［4］翁文，林文士，熊雪珠，等.纤维素型手性固定相拆分亚砜系列化合物［J］.分析化学，2006，34（6）：805-808.

High performance liquid chromatographic separation of Apremilast using chiral column

Objective：A new method for the separation of Apremilast enantiomers was developed using high performance liquid chromatography with a chiral column as the stationary phases.The composition of mobile phase，types of mobile phase additives and column temperature were optimized to get better resolution.Methods：A Chiralpak IA（4.6mm×250mm，5μm）column was used，and the mobile phase was composed of hexane-isopropanol（45∶55）with a flow rate of 1.0mL·min-1.The detection wavelength was set at 254nm. Results：Good baseline separation of Apremilast could be achieved under the optimized conditions.Conclusion：This method was simple，rapid，considerably reproducible and suitable for the enatiomers separation and the optical purity determination of Apremilast.

Apremilast High performance liquid chromatography（HPLC）Chiral column Enantioseparation

R927

B

1672-8351（2016）08-0109-03