吕 美, 陈昱凤, 何 欢, 甄广田, 肇立春

(1. 沈阳市粮油食品科学研究所 科研信息室, 沈阳 110025;2. 沈阳师范大学 实验教学中心, 沈阳 110034; 3. 沈阳师范大学 粮食学院, 沈阳 110034)



利用淀粉加工工业废水研制微生物油脂

吕 美1, 陈昱凤2, 何 欢1, 甄广田1, 肇立春3

(1. 沈阳市粮油食品科学研究所 科研信息室, 沈阳 110025;2. 沈阳师范大学 实验教学中心, 沈阳 110034; 3. 沈阳师范大学 粮食学院, 沈阳 110034)

通过研究圆红冬孢酵母(RhodosporidiumToruloidesAS 2.1389)、油脂酵母(LipomycesstarkeyiAS 2.1390)、粘红酵母 (RhodotorulaglutinisAS 2.703)、 少根根霉(Rhizopusarrhizus)、畸雌腐霉(Pythiumirregulare)、雅致枝霉 (Thamnidiumelegans)利用淀粉加工工业废水的产油特性,筛选出油脂含量最高的菌种。借助生物技术手段,利用微生物发酵方法,把使用价值较低淀粉加工工业废水转化为食用油脂。实验结果表明,粘红酵母的油脂含量最高,生物量、COD去除率也较高。最适菌种的最适培养条件为:在淀粉废水中加入15%废糖蜜,起始pH控制在6.0～7.0,在30 ℃温度下发酵7 d,油脂积累最高,菌体生长量也较高。微生物油脂提取方法采用酸热法,酸热法单位时间内处理样品的能力远高于SCF-CO2法,且设备要求低。毛油经过脱胶、碱炼、脱色、脱臭后,油脂的酸值(AV)、过氧化值(POV)指标大大降低,色泽也得到一定改观。

淀粉加工工业废水;食用油脂;酸热法

0 引 言

传统的食用油脂主要来源于动植物。当今人口不断增加,人们对油脂的需求量逐年增长[1],食用油脂出现供不应求,价格上涨的趋势。微生物油脂也称之为单细胞油脂[2],利用微生物生产油脂生产周期短,成本低,所需劳动力少,同时不受场地、季节、气候变化的影响[3],而且潜在商业化价值大,可广泛应用于保健品、饲料和生物柴油原料等方面[4]。

目前,有些淀粉加工生产企业对废水没有进行有效处理,直接排放,这些高浓度有机废水,造成严重的环境污染[5]。针对这一现状,本研究借助生物技术手段,利用微生物发酵方法,把使用价值较低的食品加工副产品----淀粉加工工业废水转化为食用油脂[6]对产油菌株利用淀粉加工工业废水为主要原料的培养基的产油特性进行了筛选;初步优化了筛选出菌种的培养工艺,以淀粉废水为主要原料,配以糖厂废糖蜜,采用液态深层培养法,培养出高富集油脂的菌体;并对菌体进行收集、油脂提取与精炼,研制出符合食用标准的微生物油脂。 利用淀粉加工工业废水,与生产微生物油脂相结合能够提供一种有效、新型的综合利用途径,多渠道开辟了油脂资源[7]。微生物油脂技术的研究开辟了新的发展方向,对解决人类新能源等问题方面起着重要作用[8]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验原料

产油微生物、淀粉加工工业废水、废糖蜜、马铃薯、葡萄糖、酵母粉、琼脂、胰蛋白胨、柠檬酸、活性白土等。

1.1.2 实验仪器

无菌操作台:SW-CJ-1D,苏州净化设备有限公司;电子天平:CP214,奥豪斯仪器(上海)有限公司;高压蒸汽灭菌设备:MLS-3781L-PC,松下健康医疗器械株式会社;摇床培养箱:HNY-2102C,天津市欧诺仪器仪表有限公司;旋转蒸发仪:RE-52A,上海亚荣生化仪器厂;电热鼓风干燥箱:101FA-0,上海树立仪器仪表有限公司;离心机:SC-3614,安徽中科中信科学仪器有限公司;框压滤机:SHFΦ200,海宁圣华过滤设备有限公司等。

1.2 工艺流程

微生物油脂生产工艺流程如下:

1.3 测定方法

1.3.1 生物量:湿菌体于65 ℃烘24 h至恒重,以g干菌体/L发酵液表示菌体生物量[9]。

1.3.2 油脂含量:索式抽提法。

1.3.3 酸值:采用GB/T 5009.37—2003。

1.3.4 过氧化值:采用GB/T 538—1995。

2 技术关键

2.1 菌体活化

选择PDA培养基为斜面活化培养基,其制备方法为将马铃薯50 g切块用水煮沸20 min,8层医用纱布过滤取汁,加葡萄糖5 g,琼脂5 g,水补足250 mL,pH自然,分装到15个18 mm×180 mm试管中,每试管装培养基量为管高的1/5,用棉塞封口,121 ℃灭菌30 min,摆放斜面。冷却后接入保藏3#菌种,温度30 ℃,湿度60%～70%,活化培养7 d。

2.2 种子的制备

种子培养基—YEPD培养基,其制备方法为1%酵母粉、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖,每250 mL三角瓶装50 mL种子培养基,用医用纱布包脱脂棉封口,121 ℃灭菌30 min。将新鲜斜面上的3#菌种接种于种子培养基中,按5%接种量接种孢子悬液,于30 ℃,200 r/min摇床培养48 h。

2.3 发酵培养

发酵培养基制备:将淀粉废水用4层纱布过滤后,加入15%糖蜜拌匀,调pH至6.0,灭菌30 min,冷却。发酵过程:将摇瓶种子液接入一级发酵罐,30 ℃培养2 d后,接种至二级发酵罐培养2 d后,接种至三级发酵罐进行发酵,培养7 d至发酵终点放罐。

2.4 菌体收集、干燥

将发酵液经过板框压滤机,截留得菌丝体,通过振动流化床干燥,得到干菌体。

2.5 菌体预处理

在微生物油脂的生产工艺中,菌体的预处理是关键工艺。微生物油脂多存在于较坚硬的细胞壁中,部分与蛋白质或糖类结合以脂蛋白、脂多糖的形式存在[10],较难分离出来;因此提油前必须对菌体进行预处理,采用细沙磨碎处理菌体。

2.6 油脂提取

菌体按每克菌6 mL的比例加入4 mol/L盐酸,振荡混匀,室温放置30 min后,沸水溶3 min,-20 ℃速冻,加入2倍体积氯仿:甲醇(1∶1)提取液,充分振荡后,5 000 r/min离心5 min,取氯仿层,挥发除去氯仿即得油脂。

2.7 微生物油脂的精炼

微生物毛油色泽深、黏度大、杂质多,有必要对其进行精炼。精炼过程:水化脱胶→碱炼→脱色→脱臭[11]。

3 结果与分析

3.1 菌种筛选

以淀粉废水为主要原料的培养基培养6种菌种:1#圆红冬孢酵母(RhodosporidiumToruloidesAS 2.1389),2#油脂酵母(LipomycesstarkeyiAS 2.1390),3#粘红酵母(RhodotorulaglutinisAS 2.703),4#少根根霉(Rhizopusarrhizus),5#畸雌腐霉(Pythiumirregulare),6#雅致枝霉(Thamnidiumelegans),比较筛选出油脂含量最高的菌种,作为下一步进行发酵条件的初步研究[12-14]。

表1 菌种在淀粉废水培养基中培养后的指标Tab.1 Indexes of strains cultivated in starch wastewater

实验结果表明,3#菌种的油脂含量最高,生物量、COD去除率也较高。因此选择以淀粉废水为主要培养基所得的结果为依据,选择生物量、油脂含量最高的菌种3#为研究对象进行下一步研究。

3.2 初步优化3#菌株发酵条件的初步研究

培养条件是影响产油微生物积累油脂的重要因素,如碳氮比、温度、培养时间、pH值等。

3.2.1 培养原料组成对3#菌株发酵产油脂的影响

碳氮比是对微生物积累油脂影响最大的因素,高碳氮比有利于积累油脂。淀粉废水中还原糖的含量较低,本实验在淀粉废水中分别加入5%、10%、15%、20%的废糖蜜,摇瓶发酵结果见表2。

表2 培养原料组成对发酵产油的影响Tab.2 Effect of cultured fermentation on the fermentation oil production

实验结果表明,在淀粉废水中加入15%废糖蜜,油脂积累最高,菌体生长量也较高。

3.2.2 培养温度对3#菌株发酵产油脂的影响

本实验温度分别选取22 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃,接种摇瓶发酵7 d,考察培养温度对菌种生长和油脂积累量的影响,实验结果见表3。

表3 温度对菌种发酵产油的影响Tab.3 Effect of temperature on the fermentation oil production

由表3结果可见,在30 ℃时菌体生长良好,发酵所得的菌体生物量、油脂量达到最高。

3.2.3 起始pH对菌种发酵产油的影响

起始pH对菌株的生长与油脂产生有着密切的关系,将发酵培养基调至不同的pH,发酵7 d后的结果见表4。

表4 起始pH对菌种发酵产油的影响Tab.4 Effect of initial pH on the fermentation oil production

由表4结果可以看出,起始pH控制在5.0～7.0较为适合,控制在6.0～7.0效果最佳。

3.3 微生物油脂提取方法的选择

本实验以筛选出的3#菌种为材料,对4种提取油脂方法的综合情况进行了比较研究[15],实验结果见表5。

表5 4种方法提取微生物油脂的综合情况比较
Tab.5 Comparison of 4 kinds of microorganisms to extract oil situation

提取方法样品设备要求处理样品能力油脂得率/%索氏法干粉较高1份/6h9.12酸热法干湿均可低10份/6h7.56SCF-CO2法干粉高1份/6h7.23有机溶剂法干湿均可低20份/6h4.58

从表5中结果可见,索氏法提取油脂的得率最高,但其设备要求高;酸热法与SCF-CO2法油脂得率相近,但酸热法单位时间内处理样品的能力远高于SCF-CO2法,且设备要求低;有机溶剂法虽简便、快速,但油脂得率较低。因此,选择酸热法作为微生物油脂提取方法。实验结果与李植峰等[16]研究的4种真菌油脂提取方法的比较研究的结果吻合。

3.4 微生物毛油精炼

微生物毛油色泽深、黏度大、杂质多,需要对其进行精炼。本实验对不同工序油品的理化指标进行了比较,结果见表6。

表6 不同精炼工序油品理化指标比较Tab.6 Comparison of different physical and chemical indicators of the oil refining process

从表6中结果可以看出,毛油经过脱胶、碱炼、脱色、脱臭后,油脂的酸值(AV)、过氧化值(POV)指标大大降低,色泽也得到一定改观。

4 结 论

1) 从试验结果可知,3#菌种的油脂含量最高,生物量、COD去除率也较高。因此,选择生物量、油脂含量最高的菌种3#为研究对象进行下一步研究。

2) 对3#菌种培养条件进行优化,在淀粉废水中加入15%废糖蜜,起始pH控制在6.0～7.0,在30 ℃温度下发酵7 d,油脂积累最高,菌体生长量也较高。

3) 微生物油脂提取方法采用酸热法,酸热法单位时间内处理样品的能力远高于SCF-CO2法,且设备要求低。

4) 毛油经过脱胶、碱炼、脱色、脱臭后,油脂的酸值(AV)、过氧化值(POV)指标大大降低,色泽也得到一定改观。

5 展 望

在自然资源日益匮乏的今天,对新资源研究开发必将成为全世界关注的热点,利用小麦加工副产品-淀粉废水培养高产油脂的微生物菌株,降低微生物油脂生产成本,使微生物油脂工业化生产成为可能。微生物油脂作为一种新型油脂新资源出现在我们面前,相信随着其生产技术的日趋完善,微生物油脂必定具有广阔发展前景。

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Investigation on production of microbial oils using industrial wastewater in starch processing

LYU Mei1, CHEN Yufeng2, HE Huan1, ZHEN Guangtian1, ZHAO Lichun3

(1. Research Information Room, Shenyang Grain and Oil Food Science Institute , Shenyang 110025, China; 2. Experimental Teaching Center, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China; 3. College of Grain Science and Technology, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China)

In this study, the oil-producing properties of rhodosporidium toruloides (AS 2.1389), lipomyces starkeyi (AS 2.1390), rhodotorula glutinis (AS 2.703), rhizopus arrhizus, pythium irregular and thamnidium elegans utilizing wastewater of starch processing industry was investigated. With the help of biological technology, the low use value industrial wastewater in starch processing could be converted into edible oils and fats using the method of microorganism fermentation. The results showed that the oil content of rhodotorula glutinis was the highest, and biomass and removal rate of COD was also high. The optimum culture conditions were 15% waste molasses into wastewater, initial pH 6.0～7.0, and 7 d of fermentation at 30 ℃. Under the conditions, the oil accumulation was the highest, and bacteria growth mass was also higher. Microbial oils were extracted by acid-heating method, for its higher efficient capacity compared with the SCF-CO2method and low requirements for equipment. After degumming, alkali refining, decolorization and deodorization, the acid value (AV) and peroxide value (POV) index of the oil was significantly reduced, and the color of oil also get a certain improvement.

industrial wastewater in starch processing; edible oils and fats; acid-heating method

2015-01-13。

沈阳市科技局科学事业费科技专项项目(2007011)。

吕 美(1981-),女,辽宁海城人,沈阳市粮油食品科学研究所高级工程师; 通信作者: 肇立春(1966-),女,辽宁丹东人,沈阳师范大学教授。

1673-5862(2016)03-0316-05

TS210.9

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2016.03.013