楚佳奇 孙杰聪 李鹏 李广盛 牛艳茹 林颢 陈光华 魏波 魏劲松 曾荣*

1. 广东医学院附属医院骨科中心，湛江 524001 2. 广东医学院附属医院干细胞研发与细胞治疗中心，湛江 524001

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是一种以全身低骨量和骨组织微结构改变、破坏为特征，能导致骨脆性增加，骨折风险性增高的全身疾病。骨质疏松性骨折(Osteoporosis fracture，OPF)是OP最严重的并发症之一，其发生、致死致残率较高，且OPF多为粉碎性，骨强度低，愈合慢，抗再骨折能力差，易发生内固定松动和再骨折。因此寻求一种更为之有效的治疗方法是众多临床及科研工作者的迫切目标。富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)中含有大量生长因子，可加快骨细胞活化，促进骨细胞增殖、血管再生，诱导骨再生，促进骨缺损修复[1, 2]。我们在前期的体外实验中已经证实，相对于单纯成骨诱导，PRP辅助诱导的人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)成骨效果更佳。

本实验拟建立SD(Sprague Dawley)大鼠OPF模型并对其进行细胞移植，通过Micro CT动态观察探讨PRP及hUC-MSCs对动物模型骨折愈合的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性SPF(Specefic pathogen Free)级SD大鼠50只，3月龄，体重250±17 g(购自广东医学院实验动物中心)。

1.2 主要材料与试剂

人脐带间充质干细胞(P3代)由广东省脐带血造血干细胞库提供，低糖L-DMEM培养基、胎牛血清(GIBCO，美国)，成骨诱导培养基(广州赛业生物科技有限公司)，7%水合氯醛，常规手术器械，动物固定台架，注射器，法国Osteospace MEDI LINK双能X线骨密度检测仪，规格1.0×250 mm骨牵引针20支(张家港市保康医疗器械有限公司)，克氏针截断器，骨科电钻，骨折模型打击支架[3]，SCANCO MEDICAL Micro CT (viva CT40)，NIKON D90数码相机。

1.3 PRP制备及成骨诱导

知情同意情况下，无菌采取足月孕产妇脐带血50 ml(预先加入10%枸橼酸钠抗凝剂)，第1次460 g室温离心8 min，超净台内吸取上层血浆及白膜层细胞，尽量去除红细胞；第2次1100 g室温离心10 min，去除约3/4上清及底层少许红细胞，剩下中间层约1 ml即为PRP，-20℃冻存备用。

P5代hUC-MSCs接种于6孔板，待细胞80%融合时加入成骨诱导培养基，每3天换液1次，培养至21天时进行茜素红染色鉴定。

1.4 制作大鼠OPF模型

SD大鼠购回后适应性饲养1周，正常饮食，笼中饲养，自由活动。根据随机数字表，将50只SD

大鼠随机分为假手术组10只，手术组40只，手术组又分为：安慰剂组、未诱导组、成骨诱导组、PRP+成骨诱导组，每组10只。术前采用双能X线骨密度检测仪对大鼠股骨远端进行骨密度(Bone mineral density，BMD)检测。大鼠麻醉后，手术组切除双侧卵巢，假手术组切除相同体积的卵巢周围组织。术后将大鼠分笼饲养，允许其自由活动。各组大鼠手术后3个月再次以同样方法，同样参数测定骨密度。确定骨质疏松造模成功后，参照前人方法进行OPF造模[4]。

1.5 细胞移植及动态观察OPF愈合

P5代细胞成骨诱导7天后消化，生理盐水重悬，细胞浓度调整为2×106/ml，移植0.5 ml细胞于动物骨折部位。细胞移植共进行3次，时间点选为OPF模型建立后1周、3周和7周。安慰剂组直接注射生理盐水，未诱导组给予未诱导的hUC-MSCs，成骨诱导组移植诱导后的hUC-MSCs，PRP+成骨诱导组移植诱导后的hUC-MSCs联合PRP(含TGF-β1 750 pg/ml)[5]。

骨折后的第1周、3周、5周、7周、11周、13周进行Micro CT扫描动物模型患肢。Micro CT扫描参数设置如下：X线能量70 kVp，114μA，8W，扫描模式BH：ALU，扫描分辨率0.038 mm，曝光时间200ms。以HP图像采集工作站及μCT Tomography(V6.1-2)图像采集分析系统进行三维重建。计算骨体积分数(Bone volume/Total volume，BV/TV)，以SPSS 17.0 做单因素ANOVA分析，P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞培养及成骨诱导

倒置显微镜下观察P5代hUC-MSCs，接种12小时后80%左右细胞均已贴壁生长，呈梭形。接种后第二天细胞约有80%融合。hUC-MSCs经成骨诱导培养21 d，茜素红染色可见间质内含大量矿盐沉积的钙化结节呈红色。

图1 光镜下细胞生长及成骨诱导后茜素红染色鉴定(40×)。 a，接种后12小时80%细胞贴壁；b，接种后24小时，细胞生长融合约80%；c，成骨诱导后21天茜素红染色，箭头所示为被染红的钙结节Fig.1 The morphology of cell growth and alizarin red staining after osteogenic induction (40×). a, There were 80% adherent cells at 12 h post-inoculation；b,Cells were grown to confluence about 80% 24 h post-seeding；c, Alizarin red staining was performed after osteogenic induction for 21 d, calcium nodules were marked with red arrows

2.2 骨密度检测

采用MEDI LINK双能X线骨密度检测仪进行骨密度扫描后分析数据：假手术组术前术后样本均数及标准差分别为0.222±0.071和0.238±0.068，P>0.05，差异无统计学意义；其它4个手术组术前术后骨密度均有不同程度降低，差异有统计学意义(P<0.01)，提示骨质疏松造模成功(表1)。

表1 假手术组，手术组术前术后样本BMD均数比较(g/cm2)Table 1 Comparison of BMD before and after operation in sham and operation group(g/cm2)

注：*假手术组术前与术后BMD比较，P>0.05；**手术组术前与术后BMD比较，P<0.01。*Comparison of BMD before and after operation in sham operation group，P>0.05；**Comparison of BMD before and after operation in operation group，P<0.01.

2.3 OPF造模

骨折术后行Micro CT观察OPF造模情况(图2)。内固定过程中， 39支克氏针正常通过大鼠股骨骨髓腔，X线摄片骨折线清晰可见。另外1只动物克氏针于股骨中下1/3处穿出骨髓腔，与股骨并行，造模失败； 1只动物进行骨折打击时击中股骨血管神经束，造成大量出血，动物死亡，造模失败； 1只动物术后第二天不明原因死亡，造模失败。总体造模成功率达92.5%。

图2 OPF造模后X线摄片观察。箭头所指为骨折断端。Fig.2 X-ray images of OPF model. The fracture area was marked with arrow

2.4 Micro CT动态观察OPF愈合

安慰剂组：在骨折后第13周骨痂仍未对骨折端形成有效包裹，与PRP+成骨诱导组第7周时的骨痂包裹量相仿(图3)；

未诱导组：骨折后第11骨痂包裹与成骨诱导组无明显区别，优于安慰剂组，13周时，骨痂量、包裹程度与成骨诱导组相仿(图3)；

成骨诱导组：第3、7周骨痂量与安慰剂组、未诱导组无明显区别，少于PRP+成骨诱导组，骨折后第11周骨痂尚未形成完全包裹，第13周时，骨折端虽被骨痂包裹，但愈合程度不及PRP+成骨诱导组(图3)；

PRP+成骨诱导组：在骨折后第3周重建即可见在骨折部位附近有少量骨痂生长，第7周时骨痂在骨折端的包裹明显优于其他组，骨折线逐渐消失；第11周时，骨痂已明显包裹骨折部位，提示进入骨折塑形期。(图3)。

图3 Micro CT 动态观察骨折愈合情况Fig.3 Fracture healing was monitored using Micro CT

2.5 Micro CT 动态监测骨体积分数

利用GraphPad Prism 5.0，以扫描时间点为横坐标，BV/TV值为纵坐标作图，可见PRP+成骨诱导组骨体积分数在各时间点明显高于其它三组(图4)。利用SPSS 17.0进行统计分析，结果表明在各个时间点安慰剂组与未诱导组差异均无统计学意义(P>0.05)，PRP+成骨诱导组各个观察周期BV/TV值均高于其他各组，差异有统计学意义(P<0.01)，成骨诱导组3、7、11周BV/TV值高于未诱导组与安慰剂组，低于PRP+成骨诱导组，差异有统计学意义(P<0.01)。

图4 Micro CT 动态观察BV/TV值变化情况Fig.4 BV/TV value was analyzed using Micro CT

3 讨论

PRP富含多种生长因子，其中转化生长因子β(Transforming growth factor β，TGF-β)是参与创伤、促进成骨的重要成分之一。TGF-β可促进前成骨细胞趋化和有丝分裂，增进胶原基质合成，同时抑制破骨细胞生成和骨吸收，从而对创伤愈合和骨组织再生起促进作用[1, 2, 6]。在移植骨和骨松质内许多细胞膜上存在着TGF-β等因子受体，如成骨细胞和前成骨细胞，当加入PRP后，高质量分数的生长因子加快了这些细胞的活化。前人研究发现，TGF-β1含量为750 pg/ml的PRP对诱导干细胞增殖、分化作用显著，因此本实验采用此浓度的PRP对细胞进行处理[5]。

hUC-MSCs在体外诱导条件下具有向成骨细胞定向分化的潜能，相对其它成体干细胞，来源更丰富，临床取材方便，分离纯度更高，具有强大的增殖与自我更新能力，免疫原性较低，蕴藏着比骨髓间充质干细胞更加优越的临床应用价值[7, 8]，目前已广泛应用于脊髓神经损伤、心肌梗死、软骨组织缺损等领域的临床应用与实验研究[9, 10]。

OP患者常伴随骨密度降低，骨强度减弱，骨折风险增加[11]。OPF的常发部位是腰椎、股骨颈等[12]。目前已有众多药物投入到临床中用以OPF的治疗，如雌激素类、双膦酸盐类、降钙素及钙制剂等，虽有疗效，但往往存在着较大副作用，并且可能会影响骨组织矿化以及骨折愈合。通常情况下，OPF比正常骨量的骨折更难愈合。正常中年大鼠的股骨骨折一般在第8周即可形成完全包裹的骨痂，进入骨痂重塑期。本实验我们以OPF大鼠模型作为研究对象，将PRP联合hUC-MSCs分三次移植骨折部位，采用Micro CT动态观察愈合效果，结果显示， PRP+成骨诱导组在第11周开始即进入骨痂重塑期，而其他组别骨痂重塑期更加滞后，比正常骨量大鼠愈合时间至少推迟了37.5%。

骨体积分数(BV/TV)是Micro CT扫描结果中的重要参数，它反应了重建范围内骨量与整个骨组织的比值，通过BV/TV能观察到不同时期骨量变化。正常骨折愈合过程主要分为3个阶段：血肿机化期，原始骨痂形成期，骨痂改造期，在这三个阶段中，BV/TV值呈上升趋势。崔燎等在对小鼠骨折进行治疗过程中采用Micro CT监测到随时间增加BV/TV值升高[13]。本实验中，我们观察到各组大鼠的骨折部位在血肿机化期和原始骨痂形成期BV/TV呈上升趋势，但在进入骨痂改造期后呈下降趋势。这可能与动物模型有关：因OP会导致雌激素分泌不足，破骨细胞活跃程度提高，在骨痂重建期相对于骨形成，骨吸收占优势，致使BV/TV的下降超过正常水平。

综上所述，PRP联合hUC-MSCs移植可促进OPF愈合，但愈合的骨组织骨体积分数并未提高，尚存在较大的再次骨折风险，如何提高骨体积分数，从根本上治疗OPF，还有待进一步研究。