李强，金约朋，白永愉，黄新策，周蒙滔



·论著 基础研究·

区域动脉灌注5-FU改善大鼠重症急性胰腺炎相关的肺损伤

李强1，金约朋2，白永愉1，黄新策1，周蒙滔2

（1.温州医科大学 第一临床医学院，浙江 温州 325035；2.温州医科大学附属第一医院 肝胆外科，浙江温州 325000）

［摘 要］目的 研究区域动脉灌注（regional arterial infusion，RAI）5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）对大鼠重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）相关的急性肺损伤（acute lung injury，ALI）的作用及其可能的机制。方法 36只健康成年雄性SD大鼠随机分成3组：对照组（C组）、胰腺炎组（SAP组）、区域动脉灌注5-FU治疗组（5-FU组）。逆行胰胆管注射5%牛磺胆酸钠（1 mL/kg）建立SAP模型。5-FU组在诱导SAP模型后立即行区域动脉灌注5-FU（40 mg/kg）治疗，C组和SAP组区域动脉灌注等量的生理盐水。建模成功后分别于12、24 h取标本并处死大鼠，胰腺和肺脏组织送病理学检查，检测肺组织湿干比，肺组织髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性，血淀粉酶和血中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。结果 与C组比较，SAP组与5-FU组血淀粉酶、血中促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）、肺组织湿干比、肺组织MPO均显著升高（P＜0.05）；与SAP组比较，5-FU组上述指标均显著下降（P＜0.05）。光镜下可见SAP组出现明显的肺损伤，5-FU区域灌注治疗后肺损伤减轻，病理学评分下降。结论 区域动脉灌注5-FU对大鼠重症急性胰腺炎相关的急性肺损伤有改善作用，其作用机制可能与抑制促炎细胞因子的过度表达有关。

［关键词］重症急性胰腺炎；急性肺损伤；5-氟尿嘧啶；区域动脉灌注；细胞因子；大鼠

重症急性胰腺炎（SAP）并发症率和死亡率高，急性肺损伤（ALI）是其中比较常见的并发症，与炎症介质的过度激活有密切的关系。临床上，5-FU治疗SAP取得了值得肯定的疗效，但其对SAP相关的ALI未见文献报道。本实验通过建立大鼠SAP相关的ALI模型，观察5-FU对SAP大鼠急性肺损伤的治疗效果，并探讨其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 材料及试剂

清洁级健康成年雄性SD大鼠，体重250～300 g，购于温州医科大学实验动物中心。5-FU注射液（天津金耀氨基酸有限公司）；牛磺胆酸钠（美国Sigma公司）；亚甲兰染色液，HE染色剂和水合氯醛（北京索莱宝科技有限公司）；PE10导管（宁波安莱软件与器械有限公司）；大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒（美国eBioscience公司）；MPO试剂盒（南京建成生物工程所）。

1.2 动物分组与模型

雄性SD大鼠36只，术前禁食12 h，不禁水。随机分成三组（n=12），每组又分成12 h和24 h两个亚组（n=6）。（1）C组：常规10%水合氯醛溶液（3 mL/kg），腹部皮下注射麻醉后开腹，仅翻动胰腺后关腹。（2）SAP组：依照Aho法［1］建立大鼠SAP模型。应用微泵逆行胰管内注射5%牛磺胆酸钠以0.1 mL/min的速度，剂量1 mL/kg。（3）5-FU组：同上SAP制模后，胃左动脉插管亚甲兰染色确定导管位置［2］后行5-FU区域动脉灌注，5-FU动脉灌注剂量40 mg/kg，灌注速度6.0 mL/h。C组和SAP组给予动脉灌注等量的生理盐水。大鼠清醒后自由饮水，禁食。

1.3 标本采集及指标检测

各组建模后12和24 h，分别再次麻醉大鼠，抽血、取标本，检测如下指标：（1）采用全自动生化仪（日本日立7600）检测血清淀粉酶；（2）采用ELISA法检测血清中的细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平；（3）采集右肺上叶用生理盐水洗净后在滤纸上吸干水分并称重，记录肺湿重。后置于80 ℃电热恒温干燥箱中烘烤72 h，再次称重，记录肺干重。肺组织湿干比计算公式：［（肺湿重-肺干重）/肺干重×100%］。（4）采集左肺制成肺组织匀浆，离心取上清液用于检测MPO活性。（5）取部分胰腺、肺组织置于4%多聚甲醛溶液中固定用于HE染色，观察肺、胰腺组织改变。胰腺组织按照Schmidt标准［3］，即根据胰腺间质水肿、腺泡细胞坏死、出血和脂肪坏死、炎症细胞浸润进行评分，每项按照严重程度分别评分为0～4分。肺组织按照Osman标准［4］，根据肺水肿和炎症细胞的浸润程度进行评分，每项按照严重程度分别评分为0～3分。由有经验的病理科医师双盲进行病理评分。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 胰腺组织光镜观察

C组大鼠胰腺镜下结构基本正常（图1，C组）。SAP组胰腺腺体结构紊乱，腺泡细胞肿胀，叶间隙增宽，可见灶性坏死，坏死区内腺泡结构消失，部分腺泡细胞空泡化，伴有炎症细胞浸润，24 h组腺泡结构破坏更加严重，炎症细胞浸润更加明显（图1，SAP组）。5-FU组与SAP组比较，胰腺间质水肿、胰腺腺泡细坏死、炎症细胞浸润均明显减轻（图1，5-FU组）。

2.2 肺组织光镜观察

C组大鼠肺组织镜下结构基本正常（图2，C组）。SAP组肺组织镜下可见肺泡和间质水肿、出血，肺泡间隔增宽或塌陷，大量炎性细胞浸润及红细胞渗出，肺组织结构紊乱，24 h组以上改变更加明显（图2，SAP组）。5-FU组与SAP组比较肺间质水肿、红细胞渗出及炎细胞浸润均减轻（图2，5-FU组）。

图1　大鼠胰腺组织HE染色（×400）

表1　各组胰腺和肺病理学评分（ ±s）表示

图2　大鼠肺组织HE染色（×400）

2.3 胰腺和肺组织的病理学评分

SAP组胰腺和肺的病理学评分最高，胰腺和肺的病理损害严重。区域动脉灌注5-FU后，胰腺和肺的病理损害程度减轻、病理学评分减少（P＜0.05）。具体见表1。

2.4 各组血淀粉酶、血清中促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）含量、肺组织湿干比、肺组织MPO活性改变

血淀粉酶SAP组与5-FU组在12 h和24 h均较对照组明显升高（P＜0.05）。区域动脉灌注5-FU治疗后血清中促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）、肺组织湿干比。中性粒细胞浸润指标MPO较SAP组均明显下降，具有统计学意义（P＜0.05）。具体见表2、表3。

表2　12 h各组血淀粉酶、TNF-α、IL-1β、IL-6的含量、肺组织湿干比、肺组织MPO活性改变

表3　24 h各组血淀粉酶、TNF-α、IL-1β、IL-6的含量、肺组织湿干比、肺组织MPO活性改变

3 讨论

重症急性胰腺炎（SAP）发生时，胰腺坏死物质吸收入血，刺激炎症细胞分泌的炎症介质如TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子触发炎症级联反应，导致全身炎症反应综合征（SIRS），严重的可导致多脏器功能衰竭（MODS），是SAP致死的主要原因［5］。其中肺损伤是SAP中最易发生也是最危险的的胰外器官损伤［6］，目前认为与炎症细胞的浸润和高浓度的炎症介质导致的肺血管损伤有密切的关系。本实验通过逆行胰胆管注射牛磺胆酸钠成功建立SAP相关的急性肺损伤模型，具体改变如下：胰腺组织病理呈典型的SAP改变，同时伴有血淀粉酶升高，肺组织病理可见肺间质水肿、肺泡间隔增宽，炎性细胞浸润及红细胞渗出。

RAI通过动脉导管灌注药物，使其直接到达病变部位，有效提高药物在胰腺的浓度，并延长药物在胰腺的接触时间，而外周血浆药物浓度增加并不明显，从而提高疗效而减少药物的毒副作用［7-9］。

自从上世纪70年代，5-FU就被用于治疗急性胰腺炎［10-11］。长期以来，5-FU被认为可干扰DNA和RNA的合成，抑制胰腺腺泡细胞合成和胰淀粉酶和胰蛋白酶的分泌［11］。关于5-FU治疗急性胰腺炎的机制的探讨，涉及多方面：一项研究表明5-FU确能诱导LPS激活的大鼠巨噬细胞凋亡［12］；也有研究表明区域动脉灌注5-FU对急性坏死性大鼠胰腺微循环缺血起到改善作用［13］；近年来有研究认为5-FU可阻断某些炎症介质的作用［14-15］，5-FU可抑制过高的促炎细胞因子和抗炎细胞因子的水平，使炎症反应维持在一个较低的水平，既防止急性胰腺炎早期的免疫过激状态，又有效地避免急性胰腺炎中后期的免疫抑制［16］。同时我们前期的研究也显示，5-FU联合奥曲肽对治疗犬急性胰腺炎起到良好的治疗效果［17］。

已有研究证实急性胰腺炎发病初期的胰腺损伤启动机体过度炎症反应，释放TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎细胞因子，诱发免疫细胞的过激状态，是诱导ALI发生的主要原因之一［18-21］。本研究结果显示，5-FU区域动脉灌注组与SAP组比较，大鼠血中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量降低显著，胰腺和肺病理损害减轻显著，说明通过区域动脉灌注5-FU治疗SAP相关的ALI效果明显。本实验评价肺损伤的指标除肺病理学检查外还包括：肺湿干比，肺组织MPO。其中肺湿干比作为肺部渗出指标，反映了肺水肿的程度。诱导SAP后肺湿干比上升，在区域动脉灌注5-FU治疗后出现下降，提示5-FU减轻了肺水肿。在ALI中，中性粒细胞的积聚起到了重要的作用，大量的中性粒细胞激活后会导致炎症级联反应，严重的会出现呼吸窘迫综合征。肺组织MPO反映了肺组织内中性粒细胞的数量，5-FU治疗后MPO的减少提示中性粒细胞在肺组织内积聚减少。

综上所述，本实验结果表明区域动脉灌注5-FU对大鼠SAP相关的ALI起到治疗作用，降低了血淀粉酶和血中促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）浓度，减少了中性粒细胞在肺组织内的过度积聚，减轻肺损伤，其主要机制可能与抑制促炎细胞因子的过度表达有关。

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（本文编辑：鲁翠涛）

·论著 基础研究·

［中图分类号］R576

［文献标识码］A

Doi:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.04.007

［收稿日期］2015-11-18

［基金项目］浙江省自然科学基金项目（LY12H03007）；国家自然科学基金项目（81370563）；浙江省医药卫生重大科技计划项目（WKJ2012-2-033）；省科技厅公益性应用项目（2012C23108）；温州市科技局项目（H20110016）。

［第一作者简介］李强（1990-），男，安徽阜阳人，在读硕士。

［通讯作者简介］周蒙滔，主任医师，博士生导师，E-mail：zmt0417@hotmail.com。and the 5-FU group increased significantly （P＜0.05）. However， compared with the SAP group at 12 and 24 h，all those parameters were attenuated in the 5-FU group （P＜0.05）. Acute lung injury was observed in SAP group under light microscope. The RAI with 5-FU attenuated the SAP associated acute lung injury and decreased the pathological scores of lungs. Conclusion 5-FU has beneficial effects on SAP associated acute lung injury in rats，which mechanism possibly involves the alleviation the overexpression of proinflammatory cytokines.

Regional arterial infusion with 5-fluorouracil attenuates acute pancreatitis associated lung in-jury in rats model

LI Qiang1， JIN Yu
e-peng2， BAI Yong-yu1， HUANG Xin-che1， ZHOU Meng-tao2. 1The First Clinical Medical College， Wenzhou Medical University， Wenzhou， Zhejiang 325035， China；2Department of Hepatobiliary Surgery， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University ， Wenzhou， Zhejiang 325000，China

Abstractobjective To assess the effects of 5-fluorouracil （5-FU） administered with regional arterial infusion （RAI） on severe acute pancreatitis （SAP） associated acute lung injury （ALI） in rats and to explore the underlying mechanisms. Methods Thirty-six male Sprague-Dawley （SD） rats were randomly divided into 3 groups: control group （C group）， severe acute pancreatitis group （SAP group）， and 5-FU administered with regional arterial infusion group （5-FU group）. SAP model was induced by 5% sodium taurocholate （1 mL/kg） injected into the pancreatic duct. 5-FU （40 mg/kg） was immediately administered with RAI to the 5-FU group following the establishment of the SAP model. Saline was administered the same way to other two groups. The pathological changes in the pancreas and lungs were observed and scored. Serum amylase activity， lung wet/dry weight ratio，lung myeloperoxidase （MPO） activity， and the level of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）and interleukin-6 （IL-6） in the serum were measured at 12 h and 24 h following the induction of SAP. Results Compared with the control group， the serum amylase activity， the levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 in the serum，lung wet/dry weight ratio， lung MPO activity， as well as the pathological scores of lungs for both the SAP group

Key wordssevere acute pancreatitis； acute lung injury； 5-fluorouracil； regional arterial infusion； cytokines；rats