张　贤，甘小凤，程正阳，都　建，罗庆礼，沈继龙，余　莉



弓形虫ROP18重组腺病毒载体的构建及其对神经干细胞C17.2凋亡的影响

张贤1,2，甘小凤1,2，程正阳1,2，都建3，罗庆礼1,2，沈继龙1,2，余莉1,2

1.安徽医科大学病原生物学教研室，合肥230032；2.人兽共患病安徽省重点实验室，合肥230032；3.安徽医科大学生物化学教研室，合肥230032

摘要：目的构建弓形虫棒状体蛋白ROP18重组腺病毒载体，研究其对神经干细胞C17.2凋亡的影响。方法将弓形虫ROP18从PEGFP-G2-ROP18重组质粒上亚克隆至腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP，重组腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP- ROP18经PCR、测序鉴定正确后，与骨架质粒pHBAd-BHG共转染HEK293细胞进行包装，收获、扩增重组腺病毒并对其滴度进行测定。以MOI=70的重组腺病毒感染神经干细胞C17.2，转染不同时间荧光显微镜观察基因的表达情况。转染48 h用CCK-8法检测C17.2的增殖情况；转染24 h采用Annexin V-APC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡情况；Western blot法检测半胱天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的蛋白水平。结果重组ROP18过表达腺病毒在C17.2神经干细胞内能有效表达。转染48 h，与空载体对照组相比，C17.2细胞增殖活性明显降低(P<0.05)；转染24 h，流式细胞术检测结果显示，ROP18基因转染组C17.2细胞凋亡率明显增加(P<0.001)；Western blot检测显示caspase-3活性片段的表达明显增加(P<0.05)。结论成功构建了弓形虫ROP18重组腺病毒并在神经干细胞C17.2中表达，ROP18重组腺病毒能诱导C17.2神经干细胞凋亡。

关键词：刚地弓形虫；棒状体蛋白18；神经干细胞C17.2；重组腺病毒；细胞凋亡

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)简称弓形虫，是顶复门的专性细胞内寄生原虫，宿主范围广泛[1]，严重危害人类健康及畜牧业的发展。弓形虫是人类重要的生物致畸因子之一，先天性感染可侵犯脑、眼、心、肺和肌肉等器官组织，引起婴儿小头畸形、脑积水和脉络膜视网膜炎等严重症状[2]。在上述器官中，中枢神经系统是最易受侵犯的部位，先天性弓形虫病的神经病理主要表现为大脑皮质发育不全[3-4]。神经干细胞(neural stem cells，NSCs)经过增殖和分化后，形成具有各种功能的神经细胞，在大脑皮质形成的过程中发挥重要作用，任何干扰NSCs正常增殖的因素均可阻碍大脑皮质的正常发育[5]。因此，研究弓形虫对NSCs的影响对于揭示弓形虫脑病的发病机制及制定相应的防治策略，具有重要意义。

棒状体是顶复合门原虫一种重要的分泌器，在入侵宿主细胞过程中分泌的棒状体蛋白(rhoptry proteins，ROPs)[6]对感染至关重要。弓形虫棒状体蛋白18(ROP18)为ROP2蛋白家族成员，具有丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶活性，是弓形虫重要的毒力决定因子，定位于宿主纳虫泡膜(parasitophorous vacuole membrane,PVM)上[7]，参与控制弓形虫在细胞内的增殖。

我们在前期的研究中发现，弓形虫与C17.2神经干细胞共培养或以弓形虫排泄分泌抗原(excreted/secreted antigens，ESAs)[8-9]刺激C17.2神经干细胞，均能诱导C17.2细胞的凋亡。而弓形虫ROP18作为虫体的一个具有激酶活性的重要毒力分子，是否会对神经干细胞的增殖和凋亡产生影响尚不明确。鉴于此，我们构建了ROP18重组腺病毒，研究其对神经干细胞的影响。

1材料与方法

1.1实验动物、虫株、细胞株与质粒清洁级5周龄昆明小鼠，雌雄不限，由安徽医科大学实验动物中心提供；弓形虫RH株速殖子由本室液氮保种，复苏后腹腔接种昆明小鼠传代；C17.2神经干细胞系由Dr. Evan Y. Snyder馈赠(The Burnham Institute for Medical Research; La Jolla, CA, USA)；293A人胚肾细胞由本室保存；PEGFP-G2-ROP18质粒由安徽医科大学都建教授馈赠。

1.2主要试剂和仪器载体pHBAd-MCMV-GFP(Hanbio公司)；DMEM培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；马血清(美国Gibco 公司)；转染试剂Lipofiter2000(美国life公司)；CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(上海贝博bestbio公司)；Annexin V-APC/PI细胞凋亡检测试剂盒(凯基KeyGEN BioTECH公司)；兔抗人半胱天冬氨酸蛋白酶3(cysteine aspartate specific protease3,Caspase-3)抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；小鼠抗人β-actin 抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；BCA蛋白定量试剂盒、Western一抗稀释液(江苏碧云天公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；化学发光成像系统(上海欧翔科学仪器有限公司)。

1.3ROP18重组腺病毒的构建

1.3.1ROP18基因扩增设计1对针对ROP18基因的特异性引物并加入酶切位点(pHBAd-MCMV-GFP载体用NotI和NsiI双酶切)，以PEGFP-G2-ROP18质粒作为扩增模板扩增ROP18全长。引物序列：上游引物：5′-ATTAGCGGCCGCATGTTTTCGGTACAGCGGCCA-3′，下游引物：5′-ACACATGCATTTATTCTGTGTGGAGATG-3′，反应参数为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，3步组成25个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，而后用Axygen公司回收试剂盒回收，紫外测定浓度。

1.3.2产物定向连接到pHBAd-MCMV-GFP载体的鉴定pHBAd-MCMV-GFP载体和ROP18-PCR产物分别用NotI和NsiI双酶切，切胶回收后，以载体100-200 ng、目的片段20 μL的比例在16 ℃连接过夜，然后转化DH5a感受态细胞，涂布于氨苄青霉素抗性的LB平板，挑可疑菌落先行PCR鉴定，再送上海桑尼生物技术有限公司测序。

1.3.3ROP18重组腺病毒的包装、扩增和纯化将293A细胞接种于60 mm培养皿，置37 ℃含5% CO2的培养箱中培养过夜。待细胞生长至底面积的70%～80%时，将pHBAd-MCMV-GFP-ROP18重组腺病毒载体质粒与骨架质粒pHBAd-BHG共转染至293A细胞。转染6 h,更换新鲜的细胞培养液,待细胞大部分病变后(约2～3 d)并从底部脱落进行收毒。将60 mm培养皿中所有细胞及培养液收于15 mL离心管中。打开恒温水浴锅至37 ℃，将15 mL离心管在液氮及37 ℃水浴反复冻融3次。于离心机离心3 000 r/min 5 min，收集含病毒的上清液，弃沉淀。该上清即为ROP18重组腺病毒，放于-80 ℃保存备用。

1.3.4ROP18重组腺病毒的滴度测定采用改良的TCID50进行测定：在96孔细胞培养板中以1×105/mL的浓度接种293A细胞，100 μL每孔，12孔为一组，共8组，重复一次。待24 h细胞贴壁以后，将病毒稀释液从1×106加到1×1013，共8个稀释度，每个稀释度加10孔，其余2孔为阴性对照， 37 ℃ CO2培养箱中培养10 d，逐日观察细胞状况，并在第10 d用显微镜观察每孔CPE情况，记录每排样品的阳性孔数。对于100 μL样品，滴度T=101+d(s-0.5)，其中d=log10稀释度，s=阳性比率之和(即从第一个10倍稀释度算起有CPE出现的阳性孔数)。再将TCID50/mL转换成PFU/mL：TCID50/mL=0.7PFU/mL，两次重复实验得到的滴度值应相差≤100.7。

1.4C17.2神经干细胞的培养C17.2神经干细胞的培养参照Evan Y. Snyder教授实验室所用标准操作流程[10]。用含10%胎牛血清，5%马血清，100 U/mL青/链霉素的DMEM完全培养液(培养液使用一周后补加1%谷氨酰胺)培养，细胞融合至90%左右传代。PBS洗两遍后，胰酶细胞消化液消化2 min，含血清的完全培养液3 mL终止消化，吹打使分散均匀，最多1∶10传代。

1.5ROP18重组腺病毒转染C17.2神经干细胞将对数生长期的C17.2神经干细胞制成1×105/mL单细胞悬液接种于6孔板，每孔2 mL，培养24 h待细胞贴壁后，PBS洗两遍。按照感染复数为1∶70转染含有ROP18重组腺病毒、腺病毒空载体(对照)至C17.2中，培养24、48、72、96 h后观察病毒的转染效率。

1.6CCK-8法检测细胞增殖将1×105/mL的C17.2神经干细胞加入96孔细胞培养板，每孔100 μL，分为4组，每组5个复孔，37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，弃去培养液，PBS洗两遍。前两组分别加入ROP18重组腺病毒、腺病毒空载体对照(MOI为70)，后两组为细胞对照组和空白对照组。腺病毒转染48 h，各孔弃一半液体，加CCK-8 溶液10 μL，在温箱中孵育2 h至肉眼颜色改变后，用酶标仪测定每孔450 nm波长光密度(optical density, OD)值，各组重复实验3次。

1.7Annexin V-APC/PI双染检测细胞凋亡将对数生长期的C17.2神经干细胞制成1×105/mL单细胞悬液接种于6孔板，每孔2 mL，培养24 h待细胞贴壁后，PBS洗两遍，加入MOI为70的ROP18重组腺病毒及腺病毒空载体，培养液换成5%胎牛血清，2.5%马血清的DMEM完全培养液。转染24 h用细胞刮收集贴壁细胞至10 mL离心管。用冷PBS洗涤细胞2次，离心800 r/min，4 ℃，10 min，弃培养液，收集细胞，加入500 μL的Binding Buffer 悬浮细胞，再加入5 μL Annexin V-APC混匀后，4 ℃避光，反应15 min。用PBS洗涤细胞一次，离心2 000 r/min，5 min后，用PBS重悬细胞，上流式仪前5 min加入5 μL PI染液混匀后室温避光孵育5 min。1 h内上流式细胞仪检测，每组实验重复3次。FCS express 4软件分析细胞凋亡率。

1.8 Western blot法检测蛋白表达收集重组腺病毒ROP18、腺病毒空载体及细胞对照组的贴壁细胞，用PBS洗2次，离心800 r/min，10 min，弃上清，每管加100 μL细胞总蛋白裂解液(99.5 μL强裂解液RIPA+0.5 μL蛋白酶抑制剂PMSF)，冰上孵育20 min后离心12 000 r/min，4 ℃，10 min，取上清液，此即为细胞总蛋白。每次各组取30 μL蛋白上样缓冲液在SDS-PAGE凝胶中电泳，200 mA恒流转膜90 min，PVDF膜放入含5%脱脂奶粉的PBST封闭2 h，弃封闭液，PBST洗涤3次，加入按1∶1 000稀释的caspase-3一抗，4℃孵育过夜，PBST洗3次后加HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，室温孵育2 h，PBST洗涤3次，ECL法显色，照相并分析结果。每组实验重复3次。

1.9统计学分析文中处理的数据结果均以均数±标准差形式表示。用t检验分析两组数据间的统计学差异，用方差分析分析两组以上数据间的统计学差异。t检验P<0.05表示差异具有统计学意义，方差分析P<0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1pHBAd-MCMV-GFP- ROP18重组腺病毒载体的鉴定重组子的鉴定结果见图1。7个克隆经PCR鉴定均检测到约1.6 kb的条带，与目的DNA的长度符合。阳性克隆经上海桑尼生物技术有限公司测序与PEGFP-G2-ROP18载体序列100%吻合。

泳道1: DNA Marker；泳道2-8：不同重组子PCR鉴定结果

Lane 1: DNA Marker;Lane2-8: PCR products of different recombinants monoclonal identification.

图1单克隆PCR鉴定结果

Fig.1Identification of recombinants using PCR

2.2ROP18重组腺病毒在293A细胞中的扩增及滴定将ROP18重组腺病毒转染至293A细胞中,每天观察细胞病变情况，约2～3 d，光镜下可见细胞变圆、变大，呈葡萄状，并在72 h左右漂起。改进的TCID50法测定重组腺病毒的滴度为1×106PFU/mL。ROP18重组腺病毒在293A细胞中的表达情况见图2。

A:荧光显微镜照片；B:明场对照

A: fluorescence expression; B: field control

图2ROP18重组腺病毒在293A细胞内的表达情况

Fig.2The 293A cell transfected by ROP18 recombinant adenovirus

2.3ROP18重组腺病毒在神经干细胞C17.2上的表达将ROP18重组腺病毒转染至C17.2神经干细胞，用荧光显微镜观察分别在转染24、48、72、96 h检测目的基因的表达情况。通过观察可见C17.2细胞在转染24、48 h时大约50%～70%表达绿色荧光蛋白，且细胞形态正常。

2.4ROP18重组腺病毒对C17.2细胞的增殖抑制作用CCK-8法检测结果显示(图4)：ROP18重组腺病毒组细胞增殖活力为(58.13±7.373)%，较腺病毒对照组(85.34±6.092)%及细胞对照组(81.51±3.415)%均有明显的下降(P<0.05)。

2.5ROP18重组腺病毒诱导C17.2神经干细胞的凋亡流式细胞术检测结果显示：ROP18重组腺病毒组细胞凋亡率为(31.07±10.05)%，较腺病毒对照组(2.707±0.050 44)%及细胞对照组(0.777 5±0.052 50)%均有明显的下降(P<0.000 1)。

A:转染24 h、B:转染48 h、C:转染72 h、D:转染96 h荧光表达与明场细胞的合图情况

A: within 24 h; B: 48 h; C: 72 h; D: 96 h.

图3ROP18重组腺病毒在C17.2神经干细胞内的表达情况

Fig.3C17.2 neural stem cells cell transfected by ROP18 recombinant adenovirus

注:*P<0.05

Western blot检测结果显示：ROP18重组腺病毒转染组，C17.2神经干细胞内的caspase-3蛋白的表达量(0.519 7±0.064 81)较腺病毒空载体对照(0.177 7±0.093 08)和细胞对照组(0.034 0±0.013 53)均有明显升高。

3讨论

弓形虫作为人兽共患病的病原体，可以入侵所有的有核细胞，孕妇感染弓形虫后会造成胎儿的畸形、流产或死胎。国内外的文献资料[11-13]显示弓形虫感染有嗜中枢性，对于中枢神经系统修复来说神经干细胞是一个有力的工具，而在成年哺乳动物脑特定区域内多功能干细胞的数量是有限的[14]。鉴于此，我们选择了C17.2神经干细胞系作为研究对象，此细胞是小鼠小脑祖细胞内所形成的永生化细胞系，具有神经干细胞的所有特征，是目前研究移植治疗神经系统疾病的神经干细胞较好的细胞系[15-16]。有研究表明弓形虫的排泄分泌抗原ESAs[17]对神经干细胞C17.2有促凋亡的作用，而ROP18蛋白作为ESAs中重要的蛋白分子，是否对神经干细胞C17.2有直接的诱导凋亡的作用尚不明确。

注:***P<0.01

注:*P<0.05,**P<0.01

本实验选择MOI=70的ROP18重组腺病毒转染C17.2神经干细胞。CCK-8法检测转染48h的细胞增殖能力，结果显示，ROP18重组腺病毒组相对于细胞对照组、腺病毒空载体组能够明显的抑制神经干细胞C17.2的增殖活力。同时，用流式细胞术检测转染24 h细胞凋亡的情况，结果显示，ROP18重组腺病毒组C17.2神经干细胞的早期细胞凋亡率有明显升高。Caspase-3是凋亡信号通路中一个重要的蛋白酶，也是凋亡的关键执行分子，在凋亡的早期阶段，它被激活[18]。本研究采取定量的WB测定ROP18重组腺病毒刺激细胞24 h的细胞凋亡蛋白caspsae-3的表达量，结果显示ROP18重组腺病毒caspase-3被激活并且表达量明显高于其他两组。上述结果表明ROP18重组腺病毒可以诱导神经干细胞C17.2的凋亡。

Wang等人[8]研究发现ESAs可以通过内质网应激信号通路(endoplasmic reticulum stress, ERS)来介导细胞的凋亡，在此次实验中选用的是感染弓形虫速殖子小鼠的原代神经干细胞。Zhou等人[9]将前期实验进一步优化，研究对象转为神经干细胞系C17.2，发现同样通过ERS途径来介导细胞的凋亡。在本实验中我们发现ROP18重组腺病毒可以介导C17.2的凋亡，但是否同样通过ERS信号通路来发挥促凋亡的作用有待于进一步的研究和验证。

综上所述，本研究成功构建了ROP18重组腺病毒并转染神经干细胞C17.2，结果表明ROP18蛋白对神经干细胞C17.2有促凋亡的作用。该研究对于明确弓形虫致中枢神经系统的损伤机制有着重要的意义。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.005

通讯作者：余莉，Email:lilyyu33@126.com

中图分类号：R382.5

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)03-0234-06

Corresponding author:Yu Li, Email:lilyyu33@126.com

收稿日期：2015-07-15；修回日期:2015-12-08

Construction of Toxoplasma ROP18 recombinant adenovirus vector and its effect on the apoptosis of C17.2 stem cells

ZHANG Xian1,2,GAN Xiao-feng1,2,CHENG Zheng-yang1,2,DU Jian3,LUO Qing-li1,2,SHEN Ji-long1,2,YU Li1,2

(1.DepartmentofMicrobiologyandParasitology,AuhuiMedicalUniversity,Hefei230032，China;2.AnhuiKeyLaboratoryofZoonoses,AuhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China;3.DepartmentofBiochemistry,AuhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Abstract:To study the effect of Toxoplasma rhoptry kinase 18 (ROP18) on the apoptosis of C17.2 neural stem cells, Toxoplasma gondii ROP18 was subcloned from PEGFP-G2-ROP18 into pHBAd-MCMV-GFP. The recombinant adenovirus vector pHBAd-MCMV-GFP-ROP18 was comfirmed by PCR and sequencing, and the identified recombinant adenovirus vector was transfected into 293 cells for packaging with skeleton plasmid. After amplification, ROP18 recombinant adenovirus (MOI=70) was transfected into C17.2 neural stem cell. The proliferation of C17.2 cells at 48 horus Post-treatment was detected using CCK-8 kit and the apoptosis of C17.2 cells at 24 hours Post-treatment was detected by flow cytometer. Western blot was used to determine the expression levels of caspase-3. ROP18 recombinant adenovirus was expressed effectively in C17.2 neural stem. Compared with the control group, proliferation of C17.2 cells was significantly decreased (P<0.05) in the ROP18 recombinant adenovirus group at 48 hours while the apoptosis of C17.2 cells was significantly increased in the ROP18 recombinant adenovirus (P<0.001) at 24 hours Post treatment and the caspases-3 expression levels was significantly increased (P<0.05). ROP18 recombinant adenovirus was successfully constructed and was highly expressed in C17.2 neural stem cells. ROP18 recombinant adenovirus induced the apoptosis of C17.2 neural stem cells.

Keywords:Toxoplasma gondii; rhoptry protein 18; neural stem cells C17.2; Toxoplasma ROP18 recombinant adenovirus; cell apoptosis Supported by the National Natural Science Foundation of People’s Republic of China (No.81572022) and the program for Excellent Talents in Anhui Medical University (No.0113014104)

国家自然科学基金(No. 81572022)资助;安徽医科大学青年拔尖人才支持计划项目(No.0113014104)资助