冯世文，李　军，曾　芸，杨　威，陈泽祥，潘艳，彭　昊



大肠杆菌O157∶H7对氟苯尼考耐药机制的初步研究

冯世文1,2,3，李军2,3，曾芸1，杨威2,3，陈泽祥2,3，潘艳2,3，彭昊2,3

1.广西大学动物科学技术学院，南宁530005；2.广西兽医研究所，南宁530001；3.广西畜禽疫苗新技术重点实验室， 南宁530001

摘要：目的研究大肠杆菌O157∶H7(E. coli O157∶H7)对氟苯尼考耐药性产生的机制。方法本研究采用亚抑菌浓度体外耐药诱导的方法将E. coli O157∶H7诱导成为氟苯尼考高度耐药菌株，采用无抗生素压力下连续传代培养或SDS方法将耐药菌株的氟苯尼考耐药性消除，使用PCR方法检测氟苯尼考耐药基因floR，通过外排泵抑制剂与氟苯尼考联合使用，检测E. coli O157∶H7是否存在对氟苯尼考的主动外排作用。结果经过36代的耐药诱导，敏感菌株对氟苯尼考产生了高度耐药(MIC为256 μg/mL)。质粒检测结果显示，耐药诱导菌株出现2个质粒，大小分别约为3 500 bp和1 200 bp，floR基因位于质粒DNA中。经连续传代培养或SDS法进行耐药消除，耐药诱导菌株对氟苯尼考的敏感性提高，但其质粒和floR基因均未丢失。结论E. coli O157∶H7氟苯尼考敏感菌和耐药菌均存在对氟苯尼考的质子驱动型外排泵和ATP水解依赖型外排泵主动外排作用。

关键词：大肠杆菌O157∶H7；氟苯尼考；耐药性；floR基因

Supported by the Science and Technology Major Projects of Guangxi (No. 14121003-4-1), the Guangxi Natural Science Foundation (No. 2013GXNSFAA019093), and the Scientific Research Projects of Guangxi Aquatic Animal Husbandry and Veterinary Bureau (No. 201528005)

大肠杆菌O157∶H7(EscherichiacoliO157∶H7，E.coliO157∶H7)是一种人兽共患病原菌，致病力强，可以在畜禽中流行和传播并通过食源性途径感染人，引起腹泻、出血性肠炎，极易继发溶血性尿毒综合症和血栓性血小板减少性紫癜等并发症[1-2]。氟苯尼考是兽医临床上治疗细菌性疾病的新型动物专用抗菌药物[3]，主要是通过与细菌70S核蛋白体的50S亚基上的A位点结合，抑制细菌肽酰基转移酶的转肽反应，使得肽链无法延伸从而抑制细菌蛋白质的合成，达到抗菌的效果[4]。氟苯尼考是兽医临床上治疗E.coliO157∶H7的有效抗生素，但是氟苯尼考的长期广泛和不科学使用，E.coliO157∶H7对氟苯尼考的耐药性增强，对公共卫生防治E.coliO157∶H7带来不利的影响。目前的研究表明，革兰氏阴性菌主要通过floR基因编码的外排泵蛋白特异性将体内的氟苯尼考泵出体外，降低细菌体内氟苯尼考的浓度，阻碍氟苯尼考发挥抑制细菌蛋白质合成的作用[5]。

为了解E.coliO157∶H7对氟苯尼考的耐药机制，本研究通过亚抑菌浓度体外耐药诱导法，将对氟苯尼考高度敏感的E.coliO157∶H7诱导成高度耐药菌株，以氟苯尼考敏感株和耐药株为受试菌，进行耐药质粒和耐药floR基因检测分析、外排泵作用、耐药消除等方面研究，为合理使用抗菌药物，减缓耐药菌产生，以及更好的改进抗菌药物活性提供参考。

1材料和方法

1.1试验菌株猪源E.coliO157：H7 RS2和FC1菌株由广西兽医研究所细菌研究室分离、鉴定、保存，菌株携带志贺样毒素2(Stx2A)和紧密黏附素基因(EaeA)，对小白鼠有较强致病力[6]。质控菌株大肠杆菌ATCC25922购自中国兽医药品监察所。

1.2主要试剂MHA和MHB培养基购自北京陆桥技术有限责任公司；氟苯尼考原粉(含量99.9%)，由广西大学动物科学技术学院兽医药理与毒理学实验室提供；二甲基亚砜(DMSO)购自国药集团化学试剂有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒、高纯度质粒小提试剂盒、2×TaqPCR Master Mix购自北京康为世纪生物科技有限公司；supercoiled DNA ladder Marker购自宝生物(大连)生物工程有限公司；DNA标准Marker购自广州东盛生物科技有限公司；十二烷基磺酸钠(SDS)购自北京索莱宝生物科技有限公司；羟基氰氯苯腙(CCCP)购自SIGMA公司；注射用奥美拉唑钠购自海南中化联合制药工业有限公司；利血平注射液购自广东邦民制药厂有限公司。

1.3最小抑菌浓度(MIC)测定以大肠杆菌ATCC25922为质控菌，按照NCCLS (2009)[7]推荐的标准微量肉汤稀释法测定氟苯尼考对E.coliO157∶H7 RS2和FC1菌株的MIC。

1.4体外耐药诱导参照文献[8]的方法，通过亚抑菌浓度的含氟苯尼考MHA培养基体外将E.coliO157∶H7 RS2和FC1菌株诱导成氟苯尼考耐药菌株。

1.5质粒检测提取E.coliO157：H7耐药诱导前后菌株的质粒，采用琼脂糖凝胶电泳方法检测菌株是否携带质粒。

1.6floR基因检测参照文献[9]合成氟苯尼考耐药floR基因检测引物，以提取的E.coliO157∶H7的质粒DNA和纯化的基因组DNA为模板，PCR方法检测floR基因。

1.7耐药消除试验将体外耐药诱导获得的E.coliO157∶H7氟苯尼考耐药菌株在无氟苯尼考压力的MHA培养基上连续传代培养至200代，测定氟苯尼考对传代培养的菌株MIC，观察耐药菌株是否恢复对氟苯尼考敏感以及质粒DNA和floR基因是否丢失。

参照文献[10]使用质粒消除剂SDS对高度耐药的E.coliO157∶H7进行质粒消除，分析质粒丢失与E.coliO157∶H7对氟苯尼考敏感性是否相关。

1.8氟苯尼考外排泵的表型检测通过测定CCCP、奥美拉唑钠和利血平3种外排泵抑制剂分别存在的情况下，氟苯尼考对E.coliO157∶H7氟苯尼考耐药诱导前后的菌株MIC是否发生改变，来判定E.coliO157∶H7对氟苯尼考是否存在主动外排作用。参照李军[8]报道的方法进行试验。

2结果

2.1氟苯尼考对E.coliO157∶H7的MIC采用微量肉汤稀释法测定了氟苯尼考对E.coliO157∶H7 RS2和FC1菌株的MIC，都为4 μg/mL，两菌株对氟苯尼考敏感。

2.2E.coliO157∶H7的耐药诱导经体外耐药诱导16代后，E.coliO157∶H7 RS2和FC1菌株对氟苯尼考由敏感(MIC为4 μg/mL)变为耐药(MIC≥32 μg/mL)，继续诱导之后，两个菌株对氟苯尼考产生了高度耐药(MIC为256 μg/mL)，为方便使用，将高度耐药菌株分别标记为RS2-256和FC1-256。

将RS2-256和FC1-256菌株在MHA培养基连续传代培养至30代，氟苯尼考对各传代菌株的MIC没有改变，表明人工体外诱导获得的E.coliO157∶H7在连续传30代内，其对氟苯尼考的耐药性稳定。

图1　氟苯尼考对大肠杆菌O157∶H7耐药诱导菌株的MIC

Fig.1The MIC of florfenicol against E. coli O157∶H7 after in vitro induced resistance

2.3质粒检测 以提取的E.coliO157∶H7氟苯尼考耐药诱导前后菌株的质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，E.coliO157∶H7耐药诱导前的RS2和FC1菌株(MIC为4 μg/mL)没有检测到质粒(图2)，而经耐药诱导后的菌株(MIC≥8 μg/mL)均检测到两个质粒带，大质粒约为3 500 bp，小质粒约为1 200 bp(图2)。

M：超螺旋 DNA ladder Marker；M3：DNA Marker3；1：耐药诱导前菌株质粒；2-10为耐药诱导后氟苯尼考MIC为8 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL、32 μg/mL、64 μg/mL、64 μg/mL、128 μg/mL、128 μg/mL、256 μg/mL、256 μg/mL的菌株的质粒。

M: supercoiled DNA ladder Marker; M3: DNA Marker3; 1: plasmid of sensitive strain RS2; 2-10: plasmid of strains whichinvitroresistance induced.

图2大肠杆菌O157∶H7氟苯尼考耐药诱导前后菌株的质粒电泳图

Fig.2Gel electrophoresis of plasmid of E. coli O157∶H7 before and after resistance induced

2.4floR基因检测分析以E.coliO157∶H7 RS2和FC1菌株，及其耐药诱导菌株的质粒和纯化的基因组DNA为模板，进行floR基因的PCR检测。结果显示，用于RS2和FC1菌株的质粒和基因组DNA均未检测到floR基因，而在耐药诱导后菌株的质粒中检测到floR基因，基因组DNA中未检测到floR基因，表明E.coliO157∶H7携带的floR基因位于耐药菌的质粒中。

2.5大肠杆菌O157∶H7氟苯尼考耐药菌株耐药消除试验

2.5.1连续传代培养消除耐药对氟苯尼考高度耐药的E.coliO157∶H7 RS2-256和FC1-256菌株在去除氟苯尼考压力的MHA培养基上连续传代培养至185代，氟苯尼考对传代菌株的MIC从256 μg/mL降至8 μg/mL，菌株恢复对氟苯尼考敏感，之后从第185代至第200代，MIC维持在8 μg/mL(图4)。然而，传代培养菌株的质粒DNA和floR基因未缺失。

图3肠杆菌O157∶H7高度耐药菌株连续传代培养后MIC的变化

Fig.3Change of MIC of florfenicol against E. coli O157∶H7 which continuously subculture in MHA without florfenicol

2.5.2SDS-温度交替法消除质粒以亚抑菌浓度SDS(1 500 μg/mL)-温度交替法进行RS2-256和FC1-256菌株的质粒消除试验，循环培养8代后，氟苯尼考对耐药菌株的MIC从256 μg/mL降低至64 μg/mL，但菌株未恢复对氟苯尼考敏感，菌株的质粒和floR基因未缺失，但是相同菌量提取的质粒DNA浓度随菌株MIC的下降而降低。

2.6氟苯尼考外排泵表型检测

2.6.1外排泵抑制剂对E.coliO157∶H7 RS2和FC1菌株的MICCCCP、奥美拉唑钠和利血平对受试菌的MIC分别为32 μg/mL、4 000 μg/mL和2 000 μg/mL。

2.6.2外排泵表型检测结果在1/2 MIC CCCP、奥美拉唑钠和利血平作用下，氟苯尼考对E.coliO157∶H7氟苯尼考敏感株和耐药株的MIC均明显下降(表1)，其中，在1/2 MIC奥美拉唑钠的作用下，RS2-256菌株对氟苯尼考由耐药变为敏感，FC1-256菌株对氟苯尼考由耐药变为中介。试验结果初步证明了E.coliO157∶H7氟苯尼考敏感株和耐药株均对氟苯尼考有主动外排作用。

表1　外排泵抑制剂作用下，氟苯尼考对大肠杆菌O157∶H7的MIC

3讨论

通过在亚抑菌浓度的抗生素培养基上连续传代培养诱导细菌产生耐药是体外诱导细菌耐药最成熟和最常用的方法[11]。本试验通过在含1/2 MIC氟苯尼考浓度的MHA培养基上连续传代培养，原本对氟苯尼考高度敏感的E.coliO157∶H7，对氟苯尼考产生高度耐药。在1/2 MIC氟苯尼考浓度持续存在下，E.coliO157∶H7敏感菌能适应生长环境，其中的部分菌体发生耐药突变，可能通过耐药基因发生位点突变，或者可能是耐药基因表达量增加，或者可能改变了氟苯尼考作用位点的结构，使得氟苯尼考的抑菌作用失效，当提高培养环境中抗菌药物的浓度时，这部分耐药突变菌被选择性富集，筛选出耐药菌。E.coliO157∶H7对氟苯尼考的耐药水平也有一定的局限性，当达到一定水平后，就很难产生更高的耐药水平，在本实验中，在达到高耐药水平(MIC≥128 μg/mL)前，氟苯尼考对菌株RS2、FC1的MIC按照 2倍梯度逐级递增，之后就很难再增长，需要更多的诱导培养代数，与田淑琴[12]报道的实验结果相似。

研究证实，氟苯尼考耐药基因floR编码的FloR蛋白位于细菌外膜上，是一种氟苯尼考特异性外排泵[13]。本试验结果显示，E.coliO157∶H7氟苯尼考敏感菌RS2和FC1菌株均未检测到质粒以及基因floR，而经耐药诱导后，MIC ≥8 μg /mL的菌株检测到分子量大小相似的质粒条带，并且检测到基因floR位于该质粒中。此外，而通过去除氟苯尼考压力连续传代培养的方法消除氟苯尼考耐药后，恢复对氟苯尼考敏感的菌株的质粒和floR基因均未丢失。试验结果提示，携带基因floR的质粒有可能就存在于E.coliO157∶H7氟苯尼考敏感菌RS2和FC1菌株中，可能由于PCR敏感性检测的局限性，未能检测到floR基因，但是经耐药诱导后，携带质粒表达量增加，基因floR表达量增加，菌株对氟苯尼考产生耐药，而在去除氟苯尼考压力下连续传代培养，其表达量降低，菌株又恢复对氟苯尼考敏感。

细菌对抗菌药物的主动外排作用是细菌产生耐药性的一个重要机制[14]。本研究将质子能驱动型外排泵抑制剂CCCP以及 ATP水解依赖型外排泵抑制剂(奥美拉唑钠和利血平)与氟苯尼考联合使用，测定E.coliO157∶H7对氟苯尼考的外排表型。试验结果表明，E.coliO157∶H7氟苯尼考耐药菌和敏感菌都存在介导对氟苯尼考主动外排的质子能驱动型外排泵和ATP水解依赖型外排泵。除了floR编码的特异性外排泵，E.coliO157∶H7是否存在能主动外排氟苯尼考的其它特异性外排泵以及(或)多药物外排泵，后续实验中将进行检测证实。

本研究初步证实，E.coliO157∶H7携带的氟苯尼考耐药基因floR位于菌株的质粒中，在氟苯尼考的存在下，floR基因表达量增加，同时可能在其它外排泵的作用下，菌株对氟苯尼考产生耐药。

细菌耐药机制是复杂的，除了耐药基因的突变、表达量改变、药物作用靶位点改变等方式，生物转化作用、细胞膜通透性改变、生物膜形成等方式也可导致细菌产生耐药性[5]。E.coliO157∶H7对氟苯尼考耐药性的产生是否也通过这些方式实现，需要试验证实。

E.coliO157∶H7对氟苯尼考的体外耐药诱导试验结果和耐药消除实验结果提示，兽医临床上应避免长期使用同一种或者同一类型抗菌药物，并注意轮换使用不同作用机制的抗菌药物，能有效减缓细菌耐药性的产生。在外排泵表型检测试验中，外排泵抑制剂奥美拉唑钠和利血平都是临床药物来源，且试验中所使用的终浓度都在临床用药剂量范围内，对E.coliO157∶H7外排泵有明显的抑制作用，试验结果提示对机体无副作用的外排泵抑制剂和抗菌药物的联合应用，不仅为耐药菌的临床用药治疗提供了新思路，还能减缓细菌耐药性的产生，外排泵抑制剂在临床上具有广阔的应用前景。

耐药质粒可以通过转化、接合转移方式在同种或不同种细菌中传播耐药基因，使得新宿主获得耐药性，将耐药菌株的耐药质粒消除对于阻止细菌耐药性传播和指导临床用药治疗耐药菌有重大意义[15]。目前的研究证实，物理方法(紫外线、高温等)、化学方法(EB、SDS等)、抗生素(如氟喹诺酮类)、中药等方法都有消除耐药质粒的作用[16]。本试验利用化学试剂SDS对氟苯尼考耐药菌株RS2-256和FC1-256进行耐药性消除，结果显示菌株的质粒带未缺失，对氟苯尼考的敏感性仍很低，即消除效果不理想。尽管通过无氟苯尼考压力下连续传代培养，E.coliO157∶H7耐药菌恢复对氟苯尼考敏感，然而却需要很长的时间。而质粒消除剂具有快速消除以及可以和抗菌药物联合使用的特点，后续将尝试使用多种质粒消除剂进行质粒消除试验，以期找到效果理想的质粒消除剂，为兽医临床治疗对氟苯尼考高度耐药细菌引起的疾病提供参考。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.012

通讯作者：曾芸，Email：yzeng323@163.com

中图分类号：R378.2

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)03-0271-05

Corresponding authors: Zeng Yun, Email: yzeng323@163.com; Li Jun, Email: yzeng323@163.com

收稿日期：2015-07-23；修回日期:2016-02-02

Antibiotic resistance mechanism of Escherichia coli O157∶H7 against florfenicol

FENG Shi-wen1,2,3,LI Jun2,3,ZENG Yun1,YANG Wei2,3,CHEN Ze-xiang2,3,PAN-yan2,3,PENG Hao2, 3

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning530005,China;2.GuangxiVeterinaryInstitute,Nanning530001,China;3.GuangxiKeyLaboratoryofAnimalVaccinesandNewTechnology,Nanning530001,China)

Abstract:We investigated the antibiotic resistance mechanism of E. coli O157∶H7 against florfenicol. Two strains of E. coli O157∶H7 which were sensitive to florfenicol were induced to be drug resistant strains by subinhibitory concentration, and the florfenicol resistance was eliminated by continuous subcultured without antibiotic pressure or with SDS. The florfenicol resistance gene floR was detected by PCR, and the efflux pump which efflux florfenicol of E. coli O157∶H7 was detected by combination efflux pump inhibitors with florfenicol. Two strains of E. coli O157∶H7 were obtained antibiotic resistance after 36 times passage culture induced with florfenicol. Results of plasmids detection showed that 2 plasmids with 3 500 bp and 1 200 bp were emerging. The floR was located in the plasmid. The plasmid and the floR of the resistant strains had not been lost after continuous subculture without antibiotic pressure or with SDS, and both florfenicol sensitive strain and resistant strain of E. coli O157∶H7 could efflux florfenicol. This study preliminarily confirmed that the floR and the function of the efflux pump of E. coli O157∶H7 contribute to the florfenicol resistance.

Keywords:E. coli O157∶H7; florfenicol; antibiotic resistance; floR

广西科技重大专项(桂科重14121003-4-1)；广西自然科学基金(桂科自2013GXNSFAA019093)；广西水产畜牧兽医局科研专项(桂渔牧科201528005)