郑　峰，刘　鹏，蔡炳冈，朱　进，潘秀珍，王长军



2型猪链球菌Rgg调控因子的序列结构分析及原核表达

郑峰，刘鹏，蔡炳冈，朱进，潘秀珍，王长军

南京军区军事医学研究所，南京210002

摘要：目的克隆2 型猪链球菌Rgg转录调控因子编码基因并进行原核表达和纯化，并对其进行生物信息学分析和结构预测。方法PCR扩增2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组的rgg基因，构建重组表达质粒pQE30-rgg，转化大肠杆菌M15，筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达，SDS-PAGE 鉴定表达产物；确定最佳诱导条件后，大量培养诱导重组表达菌，Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白，非变性PAGE电泳分析其体外聚合状态。结果整个Rgg蛋白由15个α螺旋和2个β转角组成；构建的重组质粒在宿主菌中可高效表达，15 ℃过夜诱导获得可溶性重组蛋白的比例最高；获得了较高纯度的Rgg重组蛋白，并证实其在体外可形成同源二聚体。结论成功地原核表达并纯化了Rgg重组蛋白，证明它存在二聚体结构，为进一步研究其调控机制奠定了基础。

关键词：猪链球菌；Rgg转录调控因子；原核表达

Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31300119, 31170124, 81471920) and the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK2012080)

2型猪链球菌(Streptococcussuisserotype 2，S.suis2)是猪链球菌35个血清型中分布最广、致病能力最强的一种致病菌，可感染猪和人类引起脑膜炎、关节炎、败血症、肺炎乃至急性死亡，其疫源地主要分布在北欧、东南亚一些养殖和食用猪肉的国家和地区[1-3]。我国1998年和2005年分别在江苏省和四川省暴发了S.suis2大规模感染人和猪的公共卫生事件，累计报告病例200余例，其中死亡42人[4]，使得S.suis2致病性的研究受到国内外越来越多的关注。

Rgg家族的转录调节因子广泛分布于各种革兰氏阳性菌当中。该基因首先于1992年在格氏链球菌(S.gordonii)中发现[5]，之后又在乳酸杆菌和多种链球菌中均发现了与其结构类似的调控蛋白。研究发现，Rgg家族的调控因子在不同的细菌中执行各种功能，包括控制糖代谢通路、胞外蛋白的分泌、细菌素的表达或者细菌密度感应等[6-8]。近年来，学者们也逐步聚焦于该蛋白的结构功能研究。例如，Loughman等以化脓链球菌(S.pyogenes)中的RopB蛋白为模型，证明了3个保守的氨基酸残基对于Rgg 家族的转录调节功能是必需的[9]；Parashar V等成功制备了停乳链球菌(S.dysgalactiae)中的Rgg2蛋白晶体，首次解析了Rgg家族蛋白成员的X射线三维晶体结构[10]。本实验室前期在S.suis2中国强毒株05ZYH33中对该基因进行了敲除，发现Rgg的缺失改变了345个基因的转录水平，占总基因数的15.87%，并证明它与细菌的代谢、生长周期和毒力密切相关[11]。但是对于Rgg调节因子在S.suis2中的具体调控机制，及其特异性调控转录的下游基因，我们仍知之甚少。鉴于此，本研究通过结构域检索和系统进化树等方法，对S.suis2的Rgg转录调控因子进行生物信息学分析，并在大肠杆菌中对其进行体外表达和纯化，为下一步深入研究Rgg 转录调控因子的结构和功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1质粒和菌株菌株S.suis2 05ZYH33为本实验室分离保存；表达质粒pQE30及其宿主菌E.coliDH5α和E.coliM15为本室保存；质粒pMD18-T购自TaKaRa公司。

1.1.2试剂PCR扩增试剂盒、T4连接酶为TaKaRa公司产品；DNA胶回收试剂盒为Promega公司产品；限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ、DNA marker、蛋白marker均为Fermentas产品；超滤管为Millipore公司产品；抗His-Tag单克隆抗体、辣根过氧化物酶( HRP) 标记羊抗鼠IgG购自北京天根生物技术公司；DAB 显色液购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1Rgg蛋白的生物信息学分析用Blastp和ClustalW等生物信息学工具对05ZYH33的Rgg氨基酸序列进行分析，并用ESPript 3.0[12]对Clustal W比对结果进行二级结构分析。再使用MEGA 3.1软件中的Neighbor-Joining方法绘制Rgg蛋白的系统发生树。

1.2.2目的基因的PCR 扩增及克隆根据rgg编码基因序列设计合成引物，进行PCR扩增。上游引物为5′-ggatccatgagttgttttgggaaaac-3′，划线部分为BamH I 酶切位点；下游引物为5′-aagcttctactcaataagtatcttttc-3′，划线部分为Hind Ⅲ酶切位点。引物由南京金斯瑞生物技术公司合成。PCR体系：10×Taq buffer 4 μL，2.5 mmol/ L dNTP 3 μL，模板DNA 2 μL，10 pmol/μL上游，下游引物各0.5 μL，Ex Taq 酶0.5 μL，双蒸水补至40 μL。PCR程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，试剂盒回收目的片段。将回收产物与pMD18-T载体连接转化至DH5α感受态细菌，经PCR检测为阳性者送南京金斯瑞测序鉴定。

1.2.3重组表达载体的构建和鉴定质粒pMD18T-rgg和pQE30载体分别用BamH I /Hind Ⅲ双酶切，并用胶回收试剂盒回收目的片段。4 ℃过夜连接后转化DH5α感受态，经菌液PCR检测为阳性的克隆提取质粒，进行PCR和双酶切鉴定。

1.2.4重组蛋白的表达及其纯化将重组表达载体pQE30-rgg转化E.coliM15，菌液培养至OD600值约0.6 时加入IPTG至终浓度1 mmol/L，不同温度下诱导表达4 h后收集菌体超声破碎，离心取上清与沉淀进行SDS-PAG电泳，检测目的蛋白的表达水平。将重组体扩大培养并经IPTG诱导表达，收集菌体，PBS重悬后冰浴超声破碎，离心后上清用Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白，SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白纯度。纯化蛋白透析脱盐除去咪唑，做非变性PAGE电泳分析，鉴定其是否存在聚合体结构。

1.2.5Western blot分析取纯化蛋白进行PAGE电泳，采用电转印法将蛋白转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h后，加1∶1 000稀释的His-Tag单克隆抗体，4 ℃孵育过夜，加1∶4 000稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育1 h，加底物DAB/ H2O2显色。

2结果

2.1S.suis2编码Rgg蛋白的序列结构分析将S.suis2中国强致病株05ZYH33的Rgg氨基酸序列在NCBI进行Blastp比对，结果发现该蛋白与S.dysgalactiae、无乳链球菌(S.agalactiae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、S.pyogenes、变形链球菌(S.mutans)、口腔链球菌(S.oralis) 和马链球菌兽疫亚种(S.equisubsp.zooepidemicus)中的Rgg家族蛋白的氨基酸序列分别具有26%、28%、26%、20%、40%、32%和42%的一致性。以停乳链球菌的Rgg2蛋白晶体结构(Protein data bank (PDB) ID: 4YV6 )为模型，使用ClustalW软件和ESPript 3.0对其同源蛋白进行多重序列比对和二级结构分析，结果如图1所示，它们都含有3个已证实的对于Rgg发挥转录调控功能所必需的恒定氨基酸残基：甘氨酸(G5)、精氨酸 (R12)、和色氨酸 (W150)，而且在二级结构上具有较高的相似性，整个蛋白仅由15个α螺旋和2个β转角组成，无β折叠结构。

应用RPS-Blast工具对Rgg蛋白的保守功能结构域进行检索分析，发现其N-端有数个特异的DNA结合位点，以及1个可结合DNA靶序列的螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix, HTH)基序，而该部分序列在Rgg蛋白家族成员中非常保守(图1)，提示其调控特定DNA靶序列的功能可能非常相似。此外， 等报道S.dysgalactiae的Rgg2蛋白在第45位的半胱氨酸残基可产生二硫键，使得Rgg2形成同源二聚体，但是序列比对显示其它同源蛋白在该位点上并非半胱氨酸残基(图1)。

绿色三角：3个保守氨基酸残基；红色*：S.dysgalactiae编码Rgg2蛋白的二硫键位置。

2.2Rgg蛋白的系统进化关系分析使用MEGA 4.1软件中的Neighbor-Joining方法对上述不同来源的Rgg家族蛋白做进化树分析，由结果(图2)可知，S.suis2编码的Rgg转录调控因子与变形链球菌中的同源蛋白在进化中亲缘关系最近。

2.3目的基因扩增及重组表达载体的构建以05ZYH33基因组DNA为模板，对目的基因rgg进行PCR 扩增,产物分子量与预测基因分子量大小基本相符。测序结果显示该片段全长864 bp，编码287个氨基酸，与rgg基因序列完全相同。重组表

图2　Rgg蛋白的系统发生树

Fig.2Phylogenetic tree of Streptococcal isolates based on amino acid sequences of Rgg protein

达载体pQE30-rgg通过BamH I/Hind Ⅲ双酶切后，1%琼脂糖电泳显示PCR鉴定产物和酶切片段的长度约900 bp(图3)。

M：DNA marker；1：BamH I/Hind Ⅲ双酶切鉴定；2. PCR鉴定

M: DNA marker; 1:BamH I/Hind Ⅲ double restriction enzymes; 2: Identification by PCR.

图3pQE30-rgg重组质粒的鉴定

Fig.3Identification of the recombinant plasmid pQE30-rgg

2.4重组蛋白的表达及其条件优化转化重组表达质粒pQE30-rgg的大肠杆菌M15，经1 mmol/L终浓度的IPTG于37 ℃诱导4 h后，SDS-PAGE分析表明在30 kD左右处有一明显的新生条带，分子量大小与预期一致。超声裂解菌体后离心发现，目的蛋白在37 ℃下主要是以包涵体形式表达。通过降低诱导温度至25 ℃、15 ℃，目的蛋白越来越多地以可溶性蛋白的形式表达(图4)。

M：蛋白Marker；NC：未诱导的阴性对照；T：总蛋白；S：超声破碎后上清；I：超声破碎后沉淀；箭头：目的蛋白的位置

M: Protein Marker; NC: pQE30-rgg/M15 uninduced with IPTG; T: Total protein; S: Soluble fraction; I: Insoluble fraction; arrow: Target protein.

图4SDS-PAGE检测目的蛋白在不同温度下的表达形式

Fig.4Expression analysis of target protein at different induction temperatures by SDS-PAGE

2.5重组蛋白的纯化与Western blot分析将重组表达菌转接培养37 ℃至对数期后，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，15 ℃诱导24 h。离心收集菌体，超声破碎，离心后收集上清，利用镍离子亲和层析纯化重组蛋白，电泳可见纯化产物只有一条特异的条带(图5A)，表明得到了较高纯度的Rgg重组蛋白。 Western blot 结果显示, 重组Rgg蛋白可与抗His-Tag单抗发生特异性反应, 在约33 kD 处出现明显的显色条带(图5B), 表明该蛋白条带的确是pQE30-rgg载体所表达的重组Rgg蛋白。

图A：纯化过程的SDS-PAGE分析。M：蛋白Marker；1-8：250 mM咪唑洗脱后的收集液；9：过柱前样品。图B：目的蛋白与His-tag单抗的western分析。M：蛋白Marker；1-2：纯化蛋白。

A: SDS-PAGE analysis of the purification. M: Protein Marker; 1-8: Eluted fraction with 250 mM imidazole; 9: Lysate.B: Western blot with monoclonal antibody against His-tag. M: Protein Marker; 1-2: Purified protein.

图5纯化蛋白的SDS-PAGE和western分析

Fig.5Purified recombinant protein by SDS-PAGE and Western blot

2.6纯化重组蛋白的非变性PAGE电泳分析由于文献报道有HTH基序的DNA结合蛋白能够在体外形成同质二聚体，因此我们将纯化的重组蛋白脱盐后进行了非变性PAGE电泳分析。结果如图6所示，泳道内除了之前的30 kD条带外，在约60 kD处明显增加了一条新的蛋白条带，提示Rgg重组蛋白经过纯化和脱盐后出现了二聚体结构。

M：蛋白Marker；1：纯化脱盐后的Rgg重组蛋白；箭头：蛋白二聚体

M: Protein Marker; 1: Purified Rgg recombinant protein; arrow: Homodimeric protein.

图6纯化蛋白的非变性PAGE分析

Fig.6Native-PAGE analysis of purified recombinant protein

3讨论

Rgg家族的调节因子是在革兰氏阳性菌中负责转录调控的一种保守蛋白，在各种细菌中执行不同的调控功能，例如在格氏链球菌中调节葡萄糖糖基转移酶表达的Rgg[5]、乳酸乳球菌中对酸性环境耐受所必需的GadR[13〗[14]、化脓链球菌中影响大量代谢与毒力基因表达的全局调控因子RopB[15]、无乳链球菌中调控毒力因子表达的RovS[16]。在一些细菌基因组中，如化脓链球菌[17]、肺炎链球菌[18]等，还存在多个该家族的调节因子。

我们对S.suis2中国强毒株05ZYH33基因组中05ssu1997基因编码的蛋白进行了序列比对分析，发现它同无乳链球菌、肺炎链球菌等多种链球菌中的Rgg家族调控因子均为同源蛋白，而且通过结构域分析也发现它们的N端都具有DNA结合蛋白中常见的HTH基序和Rgg家族蛋白的3个保守氨基酸残基。由序列分析结果中可见，不同细菌中的Rgg家族成员之间在氨基酸序列的一致性上并不是很高，基本不超过40%。但是其N端具有较强的保守性(图1)，而该部分正是Rgg蛋白能够结合DNA序列从而调控靶基因的功能区域，提示它们作为同一个调控蛋白家族的成员，具有其共同的结构特征和类似的调控机制。

为了下一步能更好地对Rgg调控因子进行结构和DNA结合功能的研究，其重组表达蛋白需要尽可能保持天然构象。我们前期使用了PET32a表达载体对其进行表达，发现目的蛋白主要以包涵体形式表达，而且调整诱导条件后上清中的目的蛋白含量增加不多。因此本实验更换了pQE30载体进行Rgg蛋白的原核表达，虽然37 ℃下诱导发现上清中目的蛋白量很少，但是将其置于15 ℃过夜诱导表达，目的蛋白的可溶性表达水平显著增高，超声破碎后上清中的目的蛋白量甚至多于沉淀。纯化获得最大产量的可溶性、有活性及正确折叠的Rgg重组表达蛋白，对于我们今后通过凝胶迁移阻滞等实验鉴定其下游基因和特异性DNA结合序列非常重要。

此前，Loughman等已证明了化脓链球菌中的RopB蛋白和其它拥有HTH基序的DNA结合蛋白一样能够在体外形成同质二聚体[9]，Parashar V等根据S.dysgalactiae编码Rgg2蛋白的晶体结构，证明其通过半胱氨酸(C45)产生的二硫键形成同源二聚体[10]。虽然序列比对显示S.suis2中的 Rgg蛋白在该位置上并非半胱氨酸，但本实验将其原核表达后纯化，通过非变性PAGE电泳证实其在体外也能形成二聚体结构，提示Rgg蛋白家族成员之间产生二硫键的位置或发生聚合的机制可能会有所不同。

本研究对S.suis2 中国强毒株中的Rgg调控因子进行了序列结构分析和原核表达，并获得了较高纯度的Rgg重组蛋白，该结果将有助于我们进一步研究其具体的调控功能，从而更加系统全面地认识S.suis2的致病机制。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.004

通讯作者：郑峰，Email：zhengf82@gmail.com

中图分类号：R378.1

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)03-0229-05

Corresponding author:Zheng Feng, Email: zhengf82@gmail.com

收稿日期：2015-09-07；修回日期:2015-12-09

Sequence and structure analysis of Rgg transcription regulator in Streptococcus suis serotype 2 and prokaryotic expression

ZHENG Feng,LIU Peng,CAI Bing-gang,ZHU Jin,PAN Xiu-zhen,WANG Chang-jun

(HuadongMedicalInstituteofBiotechniques,Nanjing210002,China)

Abstract:To identify and demonstrated the properties of Rgg transcription regulator in highly virulent strains of Streptococcus suis serotype 2, the rgg gene from the genomic DNA in the virulent strain 05ZYH33 was amplified by PCR and subcloned into plasmid pMD18-T and pQE30 with double digestion of BamHⅠand Hind Ⅲ. Subsequently, the prokaryotic expression plasmid pQE30-rgg was transformed to E. coli M15 after identification by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing. Upon induction with IPTG, E. coli M15 containing the recombinant plasmid could express a distinct band with a molecular weight of 30 kDa, which was similar to the predicted band of Rgg protein as demonstrated by SDS-PAGE and Western blot. It was demonstrated that the recombinant protein expression could be the highest soluble yield after induction for overnight at 15 ℃. The recombinant Rgg protein was purified by Ni2+NTA affinity chromatography. Native-PAGE results showed that the purified protein forms homodimers in vitro, consistent with data for other members of the Rgg family. Secondary structure analysis displayed Rgg protein contained 15 α-helices and 2 β-turn. These results would be useful in the further studies on the function of Rgg transcription regulator.

Keywords:Streptococcus suis; Rgg transcription regulator; prokaryotic expression

国家自然科学基金资助项目(No.31300119, 31170124, 81471920)；江苏省自然科学基金资助项目(No.BK2012080)