西安交通大学第一附属医院神经内科(西安710061)

乔　晋　王新阳△　陆文慧　秦　星



海马RAGE和BACE异常表达与SHR认知功能损害相关性研究*

西安交通大学第一附属医院神经内科(西安710061)

乔晋王新阳△陆文慧秦星

摘要目的：探讨自发性高血压大鼠海马β淀粉样蛋白(Aβ)代谢通路的变化，揭示Aβ代谢通路异常在高血压认知损害中的意义。方法： 以SHR和WKY大鼠为研究对象，使用RT-PCR和Western blot方法分别检测SHR及WKY海马RAGE、LRP-1、APP和BACE 的mRNA及蛋白质表达水平。结果：与WKY大鼠相比，SHR海马组织RAGEmRNA、BACEmRNA的表达水平明显增高(P<0.05)，而APP mRNA表达水平相对降低(P>0.05),LRP-1mRNA表达水平相对增高(P>0.05);与WKY大鼠相比，SHR海马组织RAGE、BACE的表达水平明显增高(P<0.05)，而APP和LRP-1表达水平相对增高(P>0.05)。结论: SHR海马RAGE和BACE的mRNA及其蛋白表达水平异常增高，提示Aβ代谢异常可能参与了高血压认知损害的发生机制。

主题词高血压/病理生理学认知障碍淀粉样前蛋白分泌酶@高级糖基化终末产物受体低密度脂蛋白受体相关蛋白-1大鼠

β-淀粉样蛋白 (β-amyloidprotein,Aβ) 异常沉积是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)病理的主要环节，是AD发病的关键因素和治疗靶点。Aβ是阿尔茨海默病老年斑的主要成分，其来源于淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein ，APP)的裂解。β-分泌酶(β- amyloid precursor protein cleaving enzyme ，BACE )是APP裂解过程中产生Aβ的主要限速酶。高级糖基化终末产物受体(Receptor for advanced glycation end products， RAGE)和低密度脂蛋白受体相关蛋白-1( Low-density lipid protein receptor-related potein-1，LRP-1)是负责Aβ的跨血脑屏障转运。大量流行病学证据表明血管病性危险因素在AD发病中扮演着重要角色,可以促使AD的发生和加速AD临床恶化[1]。高血压是最常见的心脑血管病危险因素，也是AD发病的重要危险因素。血管病危险因素可以造成老年人认知障碍的发生，但其导致认知损害的发生机制复杂，特别是高血压在AD发病中的作用尚未完全阐明，导致认知损害的发生是否与淀粉样蛋白的异常代谢有关，目前尚不明确。因此探索高血压大鼠Aβ代谢途径的变化，对于阐明在高血压在AD发病中的作用具有重要价值,为AD的防治提供新的理论基础。

材料和方法

1主要试剂及仪器APP抗体、BACE抗体和GAPDH抗体购自美国Cell Signal公司；HRP-抗兔IgG 和HRP-抗小鼠IgG购自美国Santa Cruz公司。Western 印迹检测试剂盒购自武汉博士德公司。Trizol试剂购自美国Inv itrogen公司, RT-PCR 试剂盒购自立陶宛Fermentas公司

2方法

2.1实验动物和标本处理

2.1.1动物:Spontaneously Hypertensive Rat SHR(14～15w)和WKY Wistar Kyoto rat大鼠(8～10周)各10只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，在西安交通大学医学实验动物中心清洁饲养到18～20周。饲养温度(24 ±2)℃,湿度(50±10)%,大鼠自由进水、进食。实验过程中SHR死亡1只

2.1.2动物处死和标本留取：腹腔注射10%水合氯醛(3.5ml/kg)麻醉动物,麻醉成功后仰卧位固定于手术板上，打开胸腔，暴露心脏，从左心室把玻璃插管插至主动脉根部，用丝线结扎以防脱落，眼科剪剪开右心房放血，经左心室主动脉插管快速灌注生理盐水100 ml。然后断头取脑，分离两侧海马组织，称重，编号，液氮罐储存，按待测指标要求留取海马组织待检。

2.2RT-PCR检测：取50～100 mg 冰冻的海马组织，Trizol一步法提取总RNA后，计算所提取RNA的A260/280值，电泳后紫外灯下观察RNA 样本的完整性。再按说明书操作反转录成cDNA, 取2μl进行后续25μl体系 PCR反应 , 扩增目的基因片段。委托上海捷瑞生物工程公司合成5对引物APP、BACE、RAGE、LRP-1和内参照GAPDH。APP上游引物：5′-GGATGCGGAGTTCGGACATG -3′，下游引物5′-GTTCTGACTCTGCTCAAAG-3′；BACE上游引物：5′-GATGGTGATGCGGAAGGACTGATT-3′，下游引物： 5′-CCGGCGGGAGTGGTATTATGAAGT-3′； RAGE上游引物：5′-CAGGGTCACAGAAACCGG-3′， 下游引物：5′-ATTCAGCTCTGCACGTTCCT-3′；LRP-1上游引物：5′-GAGTGTTCCGTGTATGGCAC-3′ ，下游引物：5′-GATGCCTTGGATGATGGTC-3′；GAPDH上游引物：5′-GGCATGGGTCAGAAGGATTCC-3′，下游引物：5′- ATG TCACGCACGATTTCCCGC - 3′。按照美国Cell signaling公司提供的TRizol试剂盒说明步骤提取RNA,然后进行逆转录和PCR扩增: ①逆转录:按照立陶宛Fermentas公司试剂盒上说明操作:逆转录条件为: 25℃, 10 min; 42℃, 60 min； 70℃, 10 min; ② PCR的条件是: APP：94℃预变性5min，94℃变性30s， 52℃退火45s，72℃延伸45s，30个循环后，72℃最终延伸7min。BACE:94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火45s,72℃延伸45s，30个循环后; 72℃最终延伸7min。RAGE:94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸45s，30个循环后， 72℃最终延伸7min。 LRP-1:94℃预变性5min，94℃变性30s;51℃退火45s， 72℃延伸45s，35个循环后 ,72℃最终延伸7min。终产物片段长度分别为298、 322、214、768和500bp。 PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳, 上样总量为15μl (扩增产物样品量10μl、5μl DNA Marker)，并在Bio-RAD凝胶成像分析仪上进行分析。以APP/GAPDH、BACE/GAPDH、RAGE/GAPDH、LRP-1/GAPDH的PCR产物的灰度值比值代表APPmRNA、BACEmRNA、mRNA、LRP-1mRNA表达水平。

2.3Western blot检测：取50～100mg海马组织进行蛋白的提取,并按照Bradford试剂盒测定蛋白的浓度。取蛋白样品30μg,经过SDS-PAGE电泳后,将凝胶中蛋白电转移至PVDF膜, 以5%脱脂奶粉TBST液封闭后,分别加入I抗APP抗体、BACE抗体、RAGE抗体、LRP-1抗体、GAPDH抗体，4℃孵育1.5h,洗涤后加入Ⅱ抗(HRP-抗兔IgG和抗小鼠IgG，1∶3000)，室温孵育1h后, ECL底物化学发光显色后曝光显影。通过Scannerk708型BenQ扫描仪成像系统进行曝光分析。分别以APP/GAPDH、BACE/GAPDH、RAGE/GAPDH、LRP-1/GAPDH 的光密度值之比代表APP、BACE、RAGE、LRP-1的表达水平。

结果

1SHR和WKY大鼠海马组织RAGE、LRP-1、APP和BACE mRNA的表达情况采用RT-PCR方法检测结果提示,与WKY大鼠相比较，SHR海马组织RAGE、BACEmRNA的表达水平明显增高，差异具有统计学意义(P<0.05)。而APP mRNA表达水平相对降低(P>0.05)；LRP-1mRNA表达水平相对增高，但两组间差异没有统计学意义(P>0.05),见表1。

2SHR和WKY大鼠海马组织RAGE、LRP-1、APP和BACE的表达情况采用Western blot方法检测结果提示,与WKY大鼠相比较，SHR海马组织RAGE、BACE的表达水平明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。而APP和LRP-1表达水平相对增高，但两组间差异没有统计学意义(P>0.05)，见表2。

表1　两组大鼠海马RAGE、LRP-1、APP和表达水平

注：与WKY比较，ΔP>0.05,*P<0.05

表2　两组大鼠海马组织的表达水平

注：与WKY比较，*P<0.05,ΔP>0.05

讨论

Aβ是阿尔茨海默病老年斑的主要成分，其来源于淀粉样前体蛋白(APP)的裂解。而BACE是APP裂解过程中产生Aβ的主要限速酶。在病理情况下，APP在BACE和γ-分泌酶的共同作用下，产生含有40～42氨基酸序列的少量Aβ42和大量Aβ40，其中Aβ40主要沉积于血管壁，而Aβ42是老年斑的主要成分之一。同时RAGE通过内吞和跨膜作用，不断的摄取外周血液中的Aβ经血脑屏障转进入脑内，而LRP-1则负责将脑间质液的Aβ经血脑屏障介导转运出脑外，这样Aβ在脑细胞间液的净含量，不但取决于由APP经BACE裂解的生成量，也受RAGE 和LRP-1的经血脑屏障转运平衡状况的影响。在遗传性家族性AD发病机制中，Aβ产生过多是其主要原因，但已有研究资料表明散发性AD发生的机制可能并不是Aβ的生成增多，而主要是由于Aβ经血脑屏障的转运减少有关[2]。

血管病性危险因素是引起血管性痴呆的的主要因素。随着人们对AD研究的不断深入，流行病学调查发现高血压等血管病性危险因素在AD发生发展中也起了一定的作用[3-4]，可以促进AD的发生或导致AD的临床恶化。但对其发生机制尚不完全清楚，大多推测与血管因素造成脑血管损害而继发脑的缺血性损害相关。我们研究发现和正常血压WKY大鼠比较，SHR大鼠海马组织APPmRNA表达不变，而BACEmRNA的表达增高，而后者表达增高有助于APP裂解生成Aβ。同时发现SHR大鼠海马组织RAGEmRNA的表达也明显增高，而LRP-1mRNA的表达变化不大，这样可能导致Aβ经血脑屏障的转运平衡发生了障碍，使得更多的Aβ转运入脑，从而增加了脑细胞间液Aβ的净含量。

进一步研究发现，SHR大鼠海马组织BACE和RAGE的表达较血压正常的WKY大鼠明显增高；而APP 和LRP-1表达水平虽也增高，但无统计学意义。因此SHR确实存在Aβ代谢通路的异常改变，可能通过上调BACE的表达造成Aβ的生产增多和通过上调RAGE的表达造成Aβ转运入脑增加，从而造成脑细胞间液Aβ净含量异常增多，导致Aβ异常沉积，进而造成海马胆碱能神经元的功能障碍，导致学习记忆功能的损害。已有研究发现AD患者和APP转基因动物模型中，RAGE在血脑屏障的表达显著上调，而LRP-1表达下调，且与Aβ的聚集有关[5]。血脑屏障上LRP-1 和RAGE 的表达异常，进而导致转运Aβ功能失衡出现脑Aβ水平异常升高,继而Aβ聚集和沉淀,形成老年斑[6]。

另外动物实验研究表明大鼠结扎双侧颈总动脉造成脑缺血模型后β-分泌酶mRNA上调接近100 %。大鼠单侧脑缺血模型后显示结扎侧大脑皮质的BACE1活性上调30 % , BACE1 蛋白量上调67 %[7]，提示脑缺血可诱发Aβ代谢紊乱，提示SHR大鼠也可能是通过高血压造成脑缺血，而后由于脑缺血导致BACEmRNA表达上调，使得Aβ生成增多；同时由于RAGEmRNA的表达上调而导致Aβ经血脑屏障的转运平衡发生了障碍，使Aβ更多转运入脑，造成脑细胞间液Aβ净含量明显增多而沉积形成老年斑。

AD患者脑内RAGE表达上调，尤其在老年斑周围神经元表面和微血管内皮细胞上表达尤为明显。RAGE与Aβ结合后，跨血脑屏障转运入脑，然后被小胶质细胞和神经元摄取诱导氧化应激反应，促进炎性因子释放，并激活NF-κB系统，使炎性反应进一步加强，同时，RAGE和Aβ结合可促进内皮素表达增多，进而诱发缺血反应，二者均可造成神经细胞的调亡。最新的利用主动脉缩窄造成高血压小鼠模型探讨了高血压认知损害和机制[8]，结果发现高血压诱导了脑小血管Aβ和小鼠认知功能的降低，进一步研究发现这种改变与血管壁上RAGE的表达上调相关，而RAGE表达上调可能与氧化应激和糖基化产物形成有关。这和我们的结果相似。

另外在我们研究发现LRP-1在SHR海马的表达和WKY上表达差异不大。但AD 患者和AD模型动物的血脑屏障上LRP-1表达显著减少[9]。但也有证据表明AD模型动物脑微血管上LRP-1的表达与Aβ沉积呈负相关[10]。而另有研究发现在抗RAGE抗体IgG能阻断Aβ对RAGE的影响，使处于丰富Aβ条件下脑微血管内皮细胞LRP-1的表达上调，说明在Aβ富集区域RAGE和LRP-1表达之间存在负相关[11]。因此脑内LRP-1的表达可能主要受脑局部微环境的影响，在疾病的不同阶段可能表达水平存在差异。

因此,我们认为高血压在AD的发生中具有一定的作用，其发生机制除了高血压造成的脑缺血有关外，也可能与β淀粉样蛋白代谢途径异常有关。但Aβ代谢异常和高血压及脑缺血之间的因果关系尚需要进一步研究。AD的发生除了被大家广为接受的Aβ沉积级联反应学说外，血管假说也是值得重视和研究，二者之间的关系密不可分，但之间的因果关系或协同作用仍不十分清楚。基于“神经血管单元”这一结构的解剖和生理理论体系，血管神经解耦联学说可能更好的诠释了血管因素和AD发病的内在联系和机制[12]，而Aβ、RAGE和BACE三者之间的相互关系是研究血管因素在AD发生中的作用焦点之一，也是AD防治的一个值得关注的潜在靶点。

参考文献

[1]乔晋, 陆文慧, 秦星.心脑血管病危险因素和阿尔茨海默病关系研究进展[J].中华脑血管病杂志(电子版),2014 ,8(2):40-43.

[2] Querfurth HW,La Ferla FM. Mechanisms of disease Alzheimer’s disease[J]. N Engl J Med, 2010,362(4):329-344.

[3] Sakurai H，Sato T, Kanetaka H,etal.Vascular risk factors and progression in Alzheimer's disease[J]. Geriatrics & Perontology International, 2011,11(2):211-214.

[4] Debette S， Seshadri S，Beiser A ，etal. Midlife vascular risk factor exposure accelerates structural brain aging and cognitive decline[J]. Neurology， 2011，77(5):461-468.

[5] Deane R , Du Yan S , Submamaryan RK,etal. RAGE mediates amyloid-β peptide transport across the blood-brain barrier and accumulation in brain[J] . Nature Med,2003 ,9 (7) :907 - 913.

[6] Deane R , Wu Z, Zlokovic BV. RAGE (Yin) versus LRP(Yang) balance regulates Alzheimer’s amyloidβ-peptide clearance through transport across the blood-brain barrier [J ] . Stroke , 2004 ,35 (11 Suppl 1) :2628 - 2631.

[7] Tohda M , Suwanakitch P , J eenapongsa P ,etal. Expression changes of the mRNA of Alzheimer’s disease related factors in the permanent ischemic rat brain[J]. Biol Pharm Bull , 2004 , 27 (12) :2021-2023.

[8] Daniela C, Giada M, ivana D,etal. Hypertension induces brain β-Amyloid accumulation,cognitive impairment, and memory deterioration through activation of receptor for advanced glycation end Products in Brain[J]. Hypertension,2012，60(1):188-197.

[9] Donahue JE,Flaherty SL,Johanson CE,etal. RAGE,LRP-1,and amyloid-beta proteinin Alzheimer’s disease[J].Acta Neuropathol,2006,112(4)：405-415.

[10] Christine AF,Kinoshita A,ithan D,etal.The low density lipoproteinreceptor-related rrotein(LRP) is a novel β-secretase(BACE1) substrate[J]. J Biol Chem,2005,280(18)：17777-17785.

[11] Deane R ，Sagare A,Hamm K,etal.IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer’s amyloid β peptide by the Blood-Brain Barrier neonatal Fc receptor[J].J Neurosci,2005,25(50)：11495-11503.

[12]Zlokovic BV. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer’s disease and other disorders[J]. Nat Rev Neurosci, 2011, 12(12): 723-738.

(收稿:2015-12-04)

【中图分类号】R363.2

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.07.06

The correlation research of abnormal expression of RAGE and BACE in Hippocampal and cognitive impairment in SHR

Department of Neurology, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710061)

Qiao JinWang XinyangLu Wenhuiet al

ABSTRACTObjective: To explore the changes of β-amyloid proteins (Aβ)metabolic pathways in spontaneously hypertensive rats and reveal significance of Aβmetabolic abnormalities in cognitive impairment related to hypertension. Methods: SHR and WKY rats as the research object, using RT-PCR and Western blot method to detect mRNA and protein expression level of RAGE, LRP - 1, APP and BACE in SHR and WKY hippocampal. Results: Compared with WKY rats, the expression levels of RAGEmRNA and BACEmRNA in SHR hippocampal tissue increased significantly (P < 0.05), whILe the APP mRNA expression level relativly decrease (P > 0.05), LRP - 1 mRNA expression level was relatively higher (P> 0.05); Compared with WKY rats, the expression level of RAGE and BACE in SHR hippocampal tissue signIFIcantly increased (P< 0.05), whILe the APP and LRP - 1 expression level was relatively higher (P> 0.05). Conclusion：Abnormal expression of mRNA and protein of RAGE and BACE in hippocampus is associated with SHR cognitive impairment, it is to say that Aβ metabolic abnormalities may be involved in the mechanism of cognitive impairment due to high blood pressure.

KEY WORDSHypertension/physiopathologyCognition disordersAmyloid precursor proteinSecretasesReceptor for advanced glycation end productsLow-density lipid protein receptor-related protein-1Rats

*陕西省卫生和计划生育委员会基金资助项目(2014D34)

△教育部环境与基因相关疾病研究室