中国医科大学附属第四医院内分泌科(沈阳110032 )

王　露　张　丹　史　亮　王　薇　杨丽刚



胰高糖素肽-1对软脂酸培养中胰岛细胞的影响

中国医科大学附属第四医院内分泌科(沈阳110032 )

王露张丹史亮王薇杨丽刚

摘要目的：探讨胰高糖素样肽-1(GLP-1)对软脂酸培养下胰岛细胞的影响。方法：体外培养胰岛细胞INS-1，将其分为空白对照组、软脂酸组(0.25 mmol/L)及GLP-1作用组(浓度分别为10nmol/L，20nmmol/L，30nmol/L)，培养24h后，取上清测定胰岛素水平及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)含量。结果：软脂酸可使胰岛素分泌量减少，GSH-Px浓度下降，MDA含量增加，GLP-1可以明显抑制软脂酸引起的上述变化，抑制作用随GLP-1浓度的增加而增强。结论：胰高糖素样-1(GLP-1)对软脂酸导致的胰岛细胞损伤有一定的保护作用，并且呈浓度依赖性。

主题词胰高糖素样肽-1谷胱甘肽过氧化物酶丙二醛细胞培养技术

胰高糖素样肽-1(GLP-1)以葡萄糖依赖的形式促进体内胰岛素的分泌，且能刺激胰岛β细胞的增殖和新生β细胞的分化，抑制其凋亡，从而增加胰岛β细胞的数量，改善胰岛β细胞功能，进一步延缓体内胰岛β细胞的衰竭[1-2]。 “脂毒性”是指血循环中游离脂肪酸浓度过高以及脂肪组织分泌的各种脂肪素含量增高所引起的致糖尿病作用。脂毒性对胰岛β细胞的数量和功能均可产生不利影响。有研究表明，软脂酸可以导致胰岛素分泌减少[3]，而应用胰高糖素样-1能否减轻此反应也不完全清楚。本实验应用软脂酸培养胰岛细胞，并进一步探讨胰高糖素样-1对此的影响。

材料与方法

1材料细胞株和试剂：大鼠胰岛细胞株INS-1(武汉大学细胞库)，软脂酸购于美国Calbiochem公司，GLP-1(Sigma公司，美国);放射免疫法测定试剂盒购自解放军总医院科技开发中心放免研究所。

2方法

2.1细胞培养：大鼠胰岛细胞株INS-1培养于含10%FBS的RPMI1640 培养基中(含10%mmol/L Hepes, 1mmol/L丙酮酸钠，50μmol/L 2- 巯基乙醇，100U/ml青霉素和100μg/ml 的链霉素)，置于37%℃，5%CO2饱和湿度培养箱常规培养，将处于对数生长期贴壁生长的INS-1 细胞用0.25%胰酶消化离心，用RPMI1640培养液制成单细胞悬液，并校正细胞浓度至1×106/ml。分别将iNS-1细胞按1×105个/ml种植于24孔板内，分为①正常对照组; ②软脂酸组(0.25 mmol/L);③GLP-1低剂量组：软脂酸0.25 mmol/L+10nmol/L GLP-1;④GLP-1中剂量组：软脂酸0.25mmol/L+ 20nmol/L GLP-1;⑤GLP-1高剂量组：软脂酸0.25 mmol/L +30nmol/L GLP-1。孵育24h收集上清液，-20°C保存。

2.2胰岛素含量:采用放免法测定。

2.3GSH-Px、MDA含量：采用比色法测定。

结果

1胰岛素含量的比较单用软脂酸培养组的胰岛素水平较对照组明显降低(P﹤0.05)，加用GLP-1干预后胰岛素水平较单用软脂酸组明显增加(P﹤0.05)，随GLP-1浓度增加改善作用逐渐增强，见附表。

2GSH-Px、MDA含量的比较单用软脂酸培养组的GSH-Px含量较对照组明显降低(P﹤0.05)，加用GLP-1干预后明显改善(P﹤0.05)，随GLP-1浓度增加改善作用逐渐增强。与对照组比较，单用软脂酸培养组的MDA含量明显增加(P﹤0.05)，经GLP-干预后明显得到抑制(P﹤0.05)，随GLP-1浓度增加抑制作用逐渐增强，见附表。

附表　各组胰岛素及GSH-Px、MDA含量的比较

注： 与对照组比较，#P﹤0.05 ，与软脂酸组比较，*P﹤0.05

讨论

本研究应用软脂酸培养胰岛细胞发现胰岛素水平明显降低，进一步证明了游离脂肪酸对胰岛细胞脂毒性的作用，脂毒性可以诱导胰岛细胞凋亡[4]，影响胰岛素分泌。李丽英等[5]也发现将大鼠胰岛β细胞置入含有过氧化氢的环境中后, 胰岛β细胞的增值活性、存活率和胰岛素分泌能力显著降低，细胞凋亡率显著升高。这其中的机制，目前比较公认的是由于内质网应激和氧化应激[6]。胰岛是所有组织中对氧化应激最敏感的组织,胰岛中抗氧化酶的含量在所有组织中是最低的。本实验也研究发现软脂酸培养组的GSH-Px含量明显减低，MDA含量明显增加，表明软脂酸组氧化应激水平明显增加。氧化应激时过剩的活性氧族可以直接对脂质、蛋白、溶酶体、DNA造成氧化损伤，大量氧自由基可使细胞膜脂质过氧化,线粒体膜形状改变,导致线粒体功能障碍,生成减少,使质膜和肌浆网膜的钙泵失活,导致细胞内游离的钙离子增多,激活磷脂酶活性,使膜磷脂分解,导致β细胞凋亡。

胰高糖素样肽-1的应用是否能保护胰岛细胞功能，到目前为止国际上也开展了各种研究。临床在应用GLP-1类似物治疗2型糖尿病患者后，可观察到载脂蛋白B/载脂蛋白A1比值显著降低，从而改善高脂血症[7]。但体外研究对GLP-1影响脂质代谢仍存有争议，认为其对脂质合成和脂质分解作用呈双重作用。有研究[8]表明，GLP-1能够增加脂肪细胞表明胰岛素受体和胰岛素底物(IRS-1)数量，促进GLUT-4的表达，从而改善胰岛素抵抗。而胰高糖素样-1是否能保护胰岛细胞，目前研究很少，本研究发现应用不同浓度的GLP-1与软脂酸共同培养胰岛细胞时，可明显改善软脂酸所致的胰岛细胞损伤，并且这种保护作用随GLP-1的浓度的增加而增强。这其中的原理可能是，GLP-1能够抑制胰岛β细胞因暴露于炎症因子、高糖及游离脂肪酸等引起的细胞凋亡，拮抗β细胞因不良环境引起的损害并促进前体细胞分化为β细胞[9]，且有学者在动物实验中发现GLP-1能够降低糖尿病鼠的氧化应激水平从而减少β细胞的凋亡并促进前体细胞分化为β细胞[10]。在本实验中就发现加入GLP-1培养后，GSH-Px含量明显增加，MDA含量明显降低，并随浓度增加，这种改变逐渐显著。

本研究发现胰高糖素样肽-1显著改善了由软脂酸造成的胰岛细胞分泌减少和氧化应激水平增加，这不仅说明氧化应激在胰岛功能损伤中起一定作用，同时也为改善胰岛功能损伤的治疗提供了一条思路。

参考文献

[1] 安欣，孙媛媛.利拉鲁肽治疗肥胖2型糖尿病合并高脂血症的临床观察[J].陕西医学杂志，2015,44(8)：1084-1085.

[2]Matthews D, Vilsboll T, Courreges J,etal. Liraglutide improves p-cell function as assessed by HOMA-B and proinsulin: Insulin ratio: Meta-analysis of 6 clinical trials[J].Diabetes,2010,59:401.

[3]黎瑶，童南伟.软脂酸对HiT-T15细胞线粒体形态功能和胰岛素分泌的影响[J].中国糖尿病杂志，2009,17(7)：502-504.

[4]黄刚娅.长期接触高浓度游离脂肪酸对大鼠胰岛β细胞凋亡的影响[J]．临床和实验医学杂志，2011,10(18)：1409-1414.

[5]李丽英,唐晓初,魏莱.GLP-1对大鼠胰岛氧化应激损伤的保护作用及机制研究[J].四川医学，2015,36(1)：25-28.

[6]Hansen M. Connecting endoplasmic reticulum stress to autophagy by unfolded protein response and Ca2+[J].Cell Death and Differentiation,2007,14:1576-1582.

[7]Chiquette E, Toth P P, Ramirez G,etal. Treatment with exenatide once weekly or twice daILy for 30 weeks is associated with changes in several cardiovascular risk markers[J].Vasc Health Risk Manag,2012,8:621-629.

[8]Lee YS, Park MS, Choung JS,etal. Glucagon-like peptide-1 inhibits adipose tissue mackophage infiltration and inflammation in an obese mouse model of diabetes[J].Diabetologia,2012,55(9):2456-2648.

[9] Kim J Y, Lim D M, Moon CI,etal.Exendin-4 protects oxidative stress-induced beta-cell apoptosis through reduced JNK and GSK3beta activity[J]. J Korean Med Sci,2010,25(11):1626-1632.

[10]崔岱，刘超，唐伟.GLP-1对大鼠胰岛细胞增殖及凋亡的影响[J]. 中国糖尿病杂志，2007,15(5)：310-312.

(收稿:2015-07-23)

【中图分类号】R392.6

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.07.03