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摘要：用AFLP分子标记手段对我国苦荞种质资源遗传多样性进行研究，为综合评价我国苦荞种质资源提供依据。以50份苦荞核心种质为试验材料，优化筛选出19对AFLP标记分析引物，经AFLP-PCR扩增、PAGE检测，统计分析AFLP图谱，运行Popgene Ver.1.31和NTSYSpc Ver.2.2软件对苦荞种质资源遗传多样性和遗传关系进行分析，共检测到211个AFLP特异性标记，平均每对引物组合产生11.11个多态性位点（PIC），遗传相似系数（GS）分布区间均较大，变幅为0.515～0.954，辛普森指数和香农指数计算结果表明来自四川的苦荞种质资源多样性最为丰富；Popgene Ver.1.31运行结果表明，当GS为0.790时，50份苦荞材料被分为5个组群，聚类结果与苦荞种质的地理分布有一定的相关性。说明AFLP是一种有效的分子标记方式，适合于苦荞种质遗传多样性分析；我国苦荞种质资源多样性丰富，须要在保护、利用现有种质资源的基础上继续加强区域间引种、育种，为我国荞麦产业的发展提供帮助。

关键词：苦荞；AFLP；遗传多样性

中图分类号： S517.024文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0122-05

苦荞（Fagopyrum tataricum）属廖科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum Mill），尼泊尔、我国西藏东部和云南西北部是苦荞的分布中心和起源地[1]。我国是苦荞的主产区，栽培面积超过30万hm2，产量水平达900 kg/hm2，总产量达3亿kg[2]。苦荞粮药兼用，不仅营养价值高，而且具有降糖脂、降胆固醇、抗氧化和消炎等功效，被誉为21世纪重要的绿色食品资源[3]。我国苦荞种质资源丰富，利用AFLP分子标记对我国苦荞种质资源遗传多样性进行分析对我国苦荞种质资源的保护、品种的改良、分子育种及优良基因的挖掘具有重要的意义。尽管国内外学者已采用形态学标记[4]、细胞学标记[5]、种子蛋白标记[6]和同功酶标记[7]等手段对荞麦的遗传多样性进行分析，但分子标记技术仍然是目前最主要的遗传多样性分析手段，国内外已采用RAPD[8]、SSR[9]、ISSR[10]和SRAP[11]等分子标记方式对苦荞遗传多样性进行了研究。AFLP是一种可靠性高、适用性强、多态性水平高的分子标记方式，非常适合于对研究背景模糊、材料来源广泛的作物进行标记分析。Tsuji等利用AFLP标记技术对野生苦荞和栽培苦荞进行了系统研究[12]；Yasui等利用AFLP标记，构建了野生荞（F. homotropicum）和甜荞的8个连锁群的遗传图谱[13]；Konishi等利用AFLP标记揭示了野生甜荞和栽培甜荞间的起源关系[14]；侯雅君等对百余份苦荞材料进行了遗传多样性分析[15]。以上研究虽利用不同的标记方式对苦荞进行了遗传多样性分析，但利用AFLP标记分析我国极具代表性的苦荞核心种质（精准鉴定品种）的研究几乎没有。尽管到目前为止国内外已有一些关于苦荞AFLP标记方面的报道，但大多数分析范围或是过于狭窄或是过于宽泛，分析材料多数不具有典型的地域代表性。本研究在前人研究的基础上，从国家种质库中精心挑选出50份极具代表性的苦荞精准鉴定材料为研究对象，从40对引物组合中筛选出19对信息量丰富、多态性好的AFLP引物，对我国苦荞种质资源进行遗传多样性分析，旨在揭示我国苦荞种质资源间的遗传关系，为苦荞种质资源的收集、保护、利用提供依据。

1材料与方法

1.1试验材料

我国苦荞精准鉴定材料50份，分别来自12个省（区），具体情况见表1，供试材料由中国农业科学院农作物种质保存中心提供。

1.2DNA提取与酶切

取0.5 g嫩叶，用CTAB法[16]提取总DNA，稀释100倍后表1苦荞品种名称及来源

编号品种名称来源编号品种名称来源1黑丰1号山西26苦荞陕西2六荞2号贵州27苦荞陕西3苦荞陕西28刺荞四川4苦荞麦安徽29苦荞贵州5苦荞陕西30苦荞宁夏6苦荞陕西31荞麦山西782-8-1安徽32荞麦甘肃8苦荞陕西33辽荞75（苦）辽宁9苦荞四川34黑苦荞青海10苦荞陕西35湖南2-2湖南11苦荞山西36塘弯苦荞湖南12威宁3号贵州37六荞1号贵州13苦荞湖北38湖南1-2湖南14额洛木尔惹四川39苦荞青海15湖南3-1湖南40湖南6-2湖南16海源苦荞宁夏41晋荞麦2号山西17凤凰苦荞湖南42苦荞青海18湖南5-2湖南43苦荞麦安徽19苦荞陕西44苦荞麦甘肃20苦荞湖北45苦荞湖北21西农9909陕西46镇巴苦荞Ⅱ陕西22彭泽苦荞江西47老鸦苦荞四川23洗马苦荞湖南48麻苦荞甘肃24苦荞湖北49新邵苦荞湖南25麻苦荞甘肃50湖南3-2湖南

参考闫龙等的试验方法[17]，37 ℃条件下用MseⅠ和EcoRⅠ对总DNA酶切8h，检测酶切效果。

1.3加接头与预扩增

将酶切产物分别加上EcoRⅠ和MseⅠ接头。在T4连接酶的作用下，16 ℃过夜连接后获得连接产物，稀释5倍后用预扩增引物M（5′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′）和E（5′-GACTGCGTACCAATTC-3′）进行预扩增反应。预扩增反应体系为：连接产物4.0 μL，M引物1.0 μL，E引物1.0 μL，10×PCR buffer 2.0 μL，dNTP 0.4 μL，Taq酶0.2 μL，ddH2O补齐至20μL。预扩增反应程序为：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 7 min。检测预扩增效果后，稀释20倍备用。

1.4引物筛选与选择性扩增

选用遗传差异较大的7份苦荞材料对40对AFLP引物组合进行筛选，筛选出扩增条带数量多、多态性好、清晰度高、分布均匀的19对引物组合：E-AA/M-CAG、E-AA/M-CTG、E-AC/M-CCC、E-AG/M-GCA、E-GA/M-CGT、E-GC/M-ACG、E-GC/M-CCT、E-GG/M-GAT、E-GG/M-GCA、E-TG/M-ACG、E-CTG/M-AC、E-CTG/M-CG、E-CTG/M-TT、E-GCT/M-CG、E-GCT/M-CT、E-GTC/M-CC、E-ACA/M-GT、E-ACT/M-CAG、E-ACT/M-CTG。获取有效的AFLP引物组合后，进行选择性扩增反应。选择性扩增反应体系为：预扩增产物2.5 μL，AFLP引物组各0.8 μL，10×PCR buffer 1.5 μL，dNTP 0.3 μL，Taq酶 0.15 μL，ddH2O补齐至15 μL。选择性扩增反应程序为：94 ℃ 1 min，94 ℃ 30 s，65 ℃ 35 s（每个循环降低0.7 ℃），72 ℃ 1 min，12个循环；94 ℃ 30 s，56 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，25个循环；72 ℃ 7 min。反应结束后加入5 μL Loading buffer，94 ℃ 变性3 min后立即置于冰上冷却备用。

1.5PAGE检测与数据统计分析

参考赵丽娟的方法[18]进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测，固定、银染、显影后用拍照计数。在电泳图谱上，清晰条带记为“1”， 同一位置上无条带记为“0”。用Popgene Ver.1.31 软件[19]计算多态性信息指数（PIC）、多态性性息位点百分数（PPB）、辛普森指数（Simpson index）、香农指数（Shannon-Weaver index）、遗传相似系数（GS）。根据GS， 采用UPGMA法，利用NTSYSpc Ver.2.2软件[20]进行苦荞品种聚类分析。

2结果与分析

2.1酶切与预扩增检测

琼脂糖凝胶电泳检测苦荞基因组DNA酶切和预扩增结果见图1。由图1-A和图1-B结果可知，DNA酶切片段均匀，预扩增片段丰富，基本位于100～750 bp之间，适宜进行选择性扩增[21]。

2.2选择性扩增检测

本研究从40对AFLP引物组合中筛选出适宜的选择性扩增引物19对，筛选率为47.5%。19对引物在50份苦荞材料上共扩增出清晰条带890条（图2），平均每对引物可扩增出条带46.84条，长度分布在45～570 bp之间。如表2所示，共扩增出多态性条带211条，平均每对引物的多态性条带有11.11条，平均多态性位点百分率（PPB）为24.05%，PIC最大值为0.1918（引物组合为E-CTG/M-CG），最小值为 0.024 1（引物组合为E-AA/M-CAG），PIC平均值为 0.123 2。

2.3苦荞种质遗传多样性分析

鉴于有些地区有代表性的苦荞核心种质材料太少，将少于4份材料的省份划分至与其毗邻或种植环境相似的省份，计算各组群苦荞种质资源的遗传多样性参数。由表3可知，AFLP标记的苦荞品种，辛普森指数为0.892～0.989，平均 0.940；香农指数为0.095～0.194，平均0.153。四川是我国苦荞遗传多样性最为丰富的地区，无论辛普森指数（0.989），还是香农指数（0.194）均为最大。虽然湖南和陕西的供试材料最多（均为10份），但遗传多样性并不丰富，这从分子水平上证明资源量与遗传多样性并非正相关的观点。安徽/江西、宁夏/青海2个组群的辛普森指数和香农指数均较低，说明该地区的苦荞种质资源多样性不够丰富，需要在保护其遗传稳定性的基础上，加强区域间引种。部分省份的核心种质抽样材料太少（如江西和辽宁各仅有1份），这也可能对遗传多样性参数值的计算造成一定的误差[22]，不能完全反映该区域内的种质资源多样性情况。

2.4苦荞种质遗传关系分析

用NTSYSpc Ver.2.2软件计算50份苦荞种质的遗传相似系数（GS）。AFLP标记结果（表4）表明，50份苦荞种质的GS值在0.515～0.954之间，分布区间较大，说明苦荞种质多态性较为丰富，同时也表明AFLP标记适宜于我国苦荞种质遗传多样性分析。

采用UPGMA法进行聚类，当GS为0.790时，大部分苦荞材料可被分成五大组群。第Ⅰ组群可分为2个小组，第1小组包括来自山西（1）、陕西（5、6）、湖南（17、18、40）、甘肃（32）和青海（39）的8份材料，其中山西和陕西的材料聚为一类，湖南、青海和甘肃的材料聚为一类；第2小组包括来自安徽（7）、陕西（21、10、19）和湖北（13、20、24）的7份材料，其中安徽（7）、陕西（21、10、19）和湖北（13）的材料聚为一类，而另2份湖北材料（20、24）聚为另一类。第Ⅱ组群可分为2个小组，第1小组又可分为2个亚组，第1亚组包括来自陕西（3、27、26）、安徽（4）、甘肃（25）、湖南（35、36、38）和山西（41）的9份材料，第2亚组包括来自安徽（43）、甘肃（44）、湖北（45）、陕西（46）和湖南（49，50）共6份材料；第2小组包括山西（11）和辽宁（33）的2份材料。第Ⅲ组群包括来自山西（31）、青海（42）、四川（47）和湖南（23）的4份材料。第Ⅳ组群包括来自贵州（2、12、29、37）、四川（9、28）和宁夏（16）的7份材料，其中来自贵州（29）和四川（28）的2份材料遗传相似度最近， 为0.954。第Ⅴ组群包括来自江西（22）、宁夏（30）和湖南（15）的3份材料。剩余的来自四川（14）、青海（34）、陕西（8）和甘肃（48）的4份材料与以上5个组群的遗传距离较远，单独聚为一类特殊的类型（图3）。

由聚类图（图3）可知，来自四川和贵州的刺荞和苦荞GS值最高（0.954），原因可能是四川的刺荞属于当地地方品种有翅苦荞的一类，而来自贵州的苦荞也是当地的一个地方品种，两者同属于苦荞的栽培品种，两地也同属我国栽培荞麦的主产区—西南地区，地理位置接近及品种交流频繁等因素导致两者遗传相似性较高。来自四川的额洛木尔惹和来自甘肃的麻苦荞GS值最低（0.515），原因可能是甘肃的麻苦荞为当地的一个栽培品种，四川的额洛木尔惹来自于川西南部的凉山彝族自治州，该地区地貌复杂，具有独特的生态气候，是我国苦荞麦主要的生产和次生起源地之一，荞麦种质资源丰富[23]，而该品种也很可能是当地野生荞麦的一个近缘种，丰富的荞麦遗传资源背景造成四川的额洛木尔惹与甘肃的麻苦荞遗传差异度较大。

3结论与讨论

3.1AFLP标记技术的有效性和适用性

自AFLP标记技术被发明以来，该技术以其特殊的标记特点被广泛应用于作物分子标记分析和遗传多样性研究中。国内外专家均认为，AFLP是一种有效的分子标记系统[24-25]。本研究的苦荞种质资源AFLP标记结果表明，AFLP标记丰富度高（19对引物组扩增出890个条带）、灵敏度强（平均每对引物扩增条带46.84个）。AFLP标记位点多态性丰富（平均多态性比率为25.7%），有效性强（平均每对引物可扩增 11.11 个多态性条带，高于RAPD标记苦荞所得的6.90个多态性条带[8]）。有效的AFLP引物组合筛选率较高（引物筛选率47.5%，高于SSR[9]和ISSR[10]的引物筛选率）。以上结果表明，AFLP是一种十分适合于苦荞种质资源多样性分析的标记方式。进一步扩大引物遴选范围，筛选出更多的AFLP扩增引物，建立苦荞AFLP引物扩增库是下一步的工作重点。

3.2苦荞种质资源的遗传多样性

从不同来源苦荞种质的遗传关系发现，我国苦荞种质资源遗传多样性十分丰富[26]；从不同组群苦荞品种的遗传参数值发现，四川地区的种质资源遗传多样性最为丰富，是我国苦荞种质资源的重点保护地区；从UPGMA聚类图发现，处于相近地理范围内的苦荞品种可聚在一起，这体现了我国苦荞种质资源遗传关系的地缘性特征。因此，需要在加强区域内苦荞种质资源保护的基础上，不断加强区域间的引种、育种，尤其是针对某些特殊珍贵品种（如四川的额洛木尔惹）的保护与开发，这将不断丰富我国苦荞种质资源的遗传多样性。本研究结果为我国苦荞种质资源的保护和利用、品种的开发以及荞麦产业的发展提供必要的参考依据。

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