孟祥金++吉挺++沈芳

摘要：利用筛选后的12对荧光标记微卫星引物分析皖南中蜂野生群与皖南中蜂保种场保种群，探讨小群保种效果。共检测确定60个个体基因型，通过计算2 个群体的优势等位基因频率（Pi）、期望杂合度（He）、多态信息含量（PIC）、群体内近交系数（Fis）分析了皖南中蜂群体内和群体间的遗传变异，采用配对试验均数差异t检验，比较了保种群体与野生群体的遗传差异。结果表明：保种群体与野生群体间的Pi 无显著性差异（P=0.440>0.05）；He略高于野生群体，差异均不显著（P=0.122），PIC 显著高于野生群体（P=0.047>0.05）；Fis显著高于野生群体（P=0.019<0.05）。结果说明，皖南中蜂采用小群保种效果良好。

关键词：皖南中蜂；微卫星DNA；遗传多样性；保种效果

中图分类号： S892文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0062-03

皖南中蜂是中华蜜蜂的重要组成，皖南中蜂具有适应性强、嗅觉灵敏、善于利用零星蜜粉源、抗病虫害、群势强、产量高等优良性状[1]。皖南中蜂已被农业部和安徽省列入第一批“地方畜禽保护品种名录”。但是长期以来，由于保种经费不足，加上西方蜜蜂的大量饲养，皖南中蜂群数锐减[2]。近几年安徽中锋开始实行小群保种。

微卫星是目前普遍使用的分子遗传标记方法，具有多态性好、共显性、易于鉴定、检测重复性好以及基因组中分布广泛等优点。联合国粮农组织（FAO）在其持续发展和管理动物遗传资源的战略计划中，推荐将微卫星标记作为优先考虑的分析工具[2-3]。近几年来微卫星标记已广泛应用于我国各地蜜蜂种质资源分析，但是目前普遍采用聚丙烯酰胺电泳加放射显影或银染的方法，不仅费时费力效率低，而且误差较大[4-6]。本研究利用筛选后的12对荧光标记微卫星引物，对保种场与野生种群遗传多样性进行比较分析，旨在初步评价小群保种的效果，继而探讨小群保种的可能性。

1材料和方法

1.1试验材料

本研究所用皖南中蜂为皖南地区保种场群体和原产地野生群体，各随机选取30群，每群随机采集成年工蜂10只，用无水乙醇溶液浸泡保存。

1.2试验方法

1.2.1基因组DNA提取基因组DNA提取参照吉挺等所建立的方法[7]，提取的基因组DNA用微量紫外可见分光光度计（NanoDrop ND-1000）测定含量与纯度，-20 ℃保存备用。

1.2.2常规引物的筛选根据课题组成员对中华蜜蜂转录组测序结果[8]所获得的3 000多个微卫星位点进行筛选，选择的原则为等位基因数目多，具有高度多态性，结合GenBank和相应文献提供的微卫星引物对所选54对引物进行优化，进一步筛选出30对扩增效果较好的微卫星引物。引物均由生工（上海）生物工程服务有限公司（Sangon）提供。

1.2.3PCR反应体系与产物扩增由于PCR反应中影响因素较多，试验分别设计了以DNA模板浓度、Mg2+浓度、Taq酶用量、退火温度为因素的梯度试验，最终确定PCR的反应体系。PCR反应体系：10×buffer 2.0 μL，25 mmol/L MgCl2 1.0 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，10 pmol/μL 上游引物 1.0 μL，10 pmol/μL下游引物1.0 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL，100 ng/μL DNA模板 1.0 μL，超纯水 13.3 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性50 s，（59～62） ℃（因不同引物而异）退火50 s，72 ℃延伸 50 s，共30个循环；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存（Eppendorf，Mastercycler pro S）。

1.2.4聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和硝酸银染色配制3%琼脂糖凝胶，点样6 μL，120 V电泳20 min，检查产物的有无。如有产物，配制8%聚丙烯酰胺凝胶80 mL体系，100 V预电泳5 min，点样10 μL，120 V电泳3 h。进行硝酸银染色，直至出现清晰的等位基因条带。

1.2.5荧光引物的筛选和组合根据聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果，尽量选择不同染色体上的引物进行标记，淘汰掉无法扩增以及无多态性的引物，最终选出相对较理想的12对多态性较丰富的微卫星引物（表1）。每对引物的上游 5′ 端分别用荧光染料FAM（蓝色）、HEX（绿色）、TAMRA（黄色）进行标记，获得的荧光标记引物避光保存。按照微卫星引物的碱基长度进行组合，为了区分得精确一些，组合的引物长度至少相差20 bp，获得的5个荧光标记微卫星引物组合信息见表1。

1.2.6荧光PCR产物STR分型PCR荧光产物送至生工（上海）生物工程有限公司进行STR分型，使用ABI-3730XL DNA Analyzer全自动测序仪检测。上样的总体积为13 μL， 其中的上样液Hi-Di Formamide 10 μL，GS-500 Size Standard 0.5 μL，另外的3 μL为混合PCR产物。将Hi-Di Formamide 和GS-500 Size Standard混合均匀后与等量的同一个体的PCR产物进行混合，然后进行个体编号，依次加样到96孔板，接着变性和检测。检测结束后，使用GeneMapper 4.0软件自动生成独立的图谱文件，读取出片段长度、峰值和峰面积，判断纯合子和杂合子（单峰为纯合子，双峰为杂合子），最后导出Excel数据表格。

1.3群体内遗传多样性分析

1.3.1等位基因频率

Pi=（2nii+nij1+nij2+…+nijn）/（2N）。

式中，Pi为第i个等位基因频率，nii为第i个等位基因纯合个数，jn为与i共显的第n个等位基因，nijn为含i与jn共显的等位基因个体数，N为群体中个体数。

1.3.2杂合度

He=1-∑ki=1Pi2。

式中：k为等位基因数，Pi为第i个等位基因频率。

1.3.3多态信息含量

PIC=1-∑ki-1Pi2-∑k-ti-1∑kj=i+12Pi2Pj2=2∑k-ji=1∑kj=i+1PiPj（1-PiPj），

式中：k为等位基因数，Pi为第i个等位基因频率，Pj为第j个等位基因频率。

1.3.4群体内近交系数

Fis=（Hs-Ho）/Hs。

式中：Ho为观察杂合度，Hs为平均期望杂合度。

1.6.5统计分析利用Microsatellite-Toolkit软件根据GeneMapper 4.0软件导出的Excel表格来计算等位基因频率与期望杂合度，根据Botestein等的公式[9]设计、计算群体的多态信息含量，再根据FSTAT程序[10]计算群体内近交系数。

2结果与分析

2.1中华蜜蜂基因组DNA提取结果

将提取的基因组DNA经TE过夜溶解后，用DanoDrop-1000浓度检测仪测定其吸光曲线与浓度。由图1可见，曲线平滑单峰，D260 nm/D280 nm介于1.8～20之间，满足微卫星位点序列扩增的要求。

2.2荧光PCR扩增产物检测分型结果

图2-A中个体G位点核心序列相差7 bp，表现为双峰，为杂合子，基因型为133/140。图2-B图中个体为单峰，纯合子，基因型为142。均无杂峰污染，扩增效果良好。

2.3保种场群体与原产地野生群体优势等位基因的比较

2个中蜂群体优势等位基因及其频率见表2。由表2可见，利用配对试验均数差异双尾t检验对2个群体优势等位基因频率进行处理，结果P=0.44>0.05，即2个群体在这12个微卫星标记检测出的优势等位基因上的差异不显著。

2.4基因库保种群体与保种场He、PIC、Fis

由表3可见，保种场的平均He为0.530 9，略高于原产地野生群（0.473 5）、对2个群体的He进行t检验，结果显示，2个群体间无显著差异（P=0.122）。保种场群体PIC、Fis 分别为0.530 9、0.407 2，均高于原产地野生群（0.422 5、0.123 8），t检验结果显示，保种场群体和野生群体之间差异显著（P值分别为0.047、0.019）。

3讨论

当前保种方法有活体保种、冷冻保种和生物技术保种3种方法，活体保种包括原产地保种和异地保种2种方式，活体保种是目前中华蜜蜂保种的唯一方式。本研究对皖南中蜂保种场和原产地野生群进行分析研究，旨在为今后中华蜜蜂的保种工作提供参考依据。

群体中的优势等位基因是物种中最原始、最保守的等位基因，其余等位基因均是由该等位基因突变形成的，因此微卫星的多态性可以反映物种的进化史[11]。本研究中保种场和原产地野生群之间优势等位基因频率存在差异，但是差异不显著（P=0.440>0.05），表明保种场保种方式有效地保存了皖南中蜂的种质特征。期望杂合度是衡量遗传变异程度的最佳参数；多态信息含量表示微卫星DNA变异程度的高低，反映群体内个体遗传变异的程度，数值越高表明变异程度越高。本研究中保种场He、PIC均高于原产地野生群，表明保种场群体的遗传多样性得到了很好的保存。

本研究对皖南中蜂保种场和原产地野生群进行遗传多样性检测分析。结果表明，皖南中蜂保种场和原产地野生群之间的Pi、He均差异不显著，PIC显著增加，Fis显著上升。其中，保种场群体的He略高于原产地，PIC显著高于原产地；表明基因库通过利用群体内随机交配和家系间随机交配高效保持了保种群体的多样性。出众的飞翔能力使得蜂王在野生状态独特的自然环境中可以和其他起源的雄蜂发生基因交流，所以Fis很低；但是保种场群体有限，蜂王雄蜂的交配又难以控制，最终导致Fis显著升高；这提醒我们在以后的保种工作中应该扩大群体规模，采用人工授精技术，准确记录系谱资料，并且根据群体的具体情况适当引入雄蜂血统，避免近交对保种效果的不利影响，降低Fis，有效避免近交衰退。

综上所述，本研究利用筛选的12对微卫星DNA标记分析皖南中蜂保种群和原产地群体的遗传多样性，对皖南中蜂保种效果进行评价。结果表明，皖南中蜂遗传多样性丰富，具有很高的保种价值；同时也表明对地方中蜂品种进行小群保种是可行的，为更好地评价、保护和利用我国的中蜂资源提供一定的科学依据。

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