龚丽++李云霞

摘要：运用基因克隆技术，以分离鉴定获得的蛋白水解酶高活性类芽孢杆菌（Paenibacillus lautus）CHN26菌株的基因组DNA为模板，经克隆鉴定该菌株是一种新型ATP-依赖型ClpP家族蛋白水解酶PlclpP基因，全长585 bp，编码194个氨基酸，分子量约为21 ku。采用大肠杆菌（Eschericia coli）pET表达系统构建PlclpP基因表达质粒pET-28-PlclpP，并在大肠杆菌BL21中实现了重组PlClpP蛋白的表达。利用组氨酸标签（His-tag）亲和纯化法获得 PlClpP 纯化蛋白，发现PlClpP可能与宿主菌未知伴侣分子形成蛋白复合物。PlClpP复合物具有ATP-依赖型酪蛋白水解酶活性，最适反应温度为40 ℃、pH值7.0。表面活性剂强烈抑制PlClpP复合物的酶活性，而常规丝氨酸蛋白酶抑制剂对其活性没有抑制作用。本研究结果为蛋白酶新基因资源的开发、ClpP家族蛋白酶的基础理论和应用研究奠定了基础。

关键词：ClpP家族蛋白水解酶；类芽孢杆菌；基因；克隆；表达；酶学特性

中图分类号： Q789文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0047-04

蛋白水解酶约占全球酶制剂市场的60%，被广泛应用于食品、医药、洗涤剂、农业等领域[1]。微生物是水解酶的主要来源，探索并开发微生物新基因资源，对于解决目前商品化酶制剂种类及来源较少、底物单一、价格昂贵等问题具有重要意义。

ClpP（caseinolytic peptidase）家族ATP-依赖型伴侣分子相连（chaperone-linked）的酪蛋白水解肽酶广泛存在于原核生物及真核生物中[2]，其利用ATP驱动蛋白底物解折叠并转位进入蛋白水解腔（chamber）中降解成小分子肽[3]。1988年，ClpP蛋白酶首次被发现于大肠杆菌（Eschericia coli）中[4]。此后的大量研究表明，大肠杆菌中ClpP蛋白酶（EcClpP）由蛋白水解核心ClpP、依赖ATP的伴侣分子ClpA或ClpX组成，其蛋白水解腔由催化位点序列形成的2个反向同型七聚体环构成[2]。……