柳文静，闵　霞，高　雅，卫静丽，史晓昀，郑冬超

(四川大学　生命科学学院，成都　610065)



曼地亚红豆杉愈伤组织诱导条件探索

柳文静，闵霞，高雅，卫静丽，史晓昀，郑冬超

(四川大学生命科学学院，成都610065)

摘要该项目以曼地亚红豆杉为试材，研究外植体取材部位、激素种类及浓度组合、光照条件等培养条件对愈伤组织诱导的影响，以找出最适合曼地亚红豆杉愈伤组织生长的培养条件。实验结果发现，最适合诱导曼地亚红豆杉愈伤组织生长的激素组合为0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+2 mg/L 2，4-D；最适合外植体为带芽茎段；黑暗培养相比光照培养更有利于愈伤组织生长。该项目的开展可为紫杉醇细胞培养生产体系提供理论指导。

关键词曼地亚红豆杉；培养条件； 愈伤组织；诱导

紫杉醇(Paclitaxel)是从红豆杉属(Taxus sp.)植物中分离出的一种具有独特抗癌活性的二萜类化合物，是目前最有效的抗肿瘤药物之一[1]。由于紫杉醇结构复杂，通过化学手段合成很难实现大规模生产，目前其来源主要是从红豆杉属植物的树皮中提取分离，然而红豆杉属植物资源短缺、生长缓慢，难以满足日益增长的临床试验需求。近年来，利用组织细胞培养法生产紫杉醇已成为目前的研究热点，并已取得了巨大进展[2-7]。但是要实现紫杉醇大规模生产，必须进一步解决红豆杉细胞培养生长缓慢的问题，提高细胞中的紫杉醇含量。

目前已有一些利用曼地亚红豆杉细胞培养生产紫杉醇的研究[11-12]，但相对较少，且还未形成体系。本研究以曼地亚红豆杉为材料，探讨不同外植体、植物激素种类及水平、光照条件等因素对曼地亚红豆杉愈伤组织诱导的影响，以期为大规模培养红豆杉细胞、扩大紫杉醇生产奠定理论基础。

1材料与方法

1.1材料

本研究采用的实验材料为2013年9月种植于四川大学生物科学实验教学中心苗圃的两年生曼地亚红豆杉植株及沙藏保存两年的种子。

1.2外植体消毒和接种

1.3愈伤组织诱导培养条件

表1　红豆杉愈伤组织诱导处理的各激素种类及浓度组合

1.4数据统计与处理

2结果与分析

2.1激素种类及水平对曼地亚红豆杉愈伤组织诱导效果的影响

表2　不同激素组合处理下的曼地亚红豆杉愈伤组织诱导效果

2.2外植体部位对曼地亚红豆杉愈伤组织诱导效果的影响

表3　不同外植体部位对曼地亚红豆杉愈伤组织诱导效果

(a) 叶片

(b) 幼嫩茎段

(c) 带芽茎段

(d) 胚乳图1　不同外植体部位对曼地亚红豆杉愈伤组织的诱导效果

2.3光照条件对曼地亚红豆杉愈伤组织生长的影响

为了研究光照条件对红豆杉愈伤组织诱导的影响，我们以曼地亚红豆杉诱导30 d所形成的愈伤组织为材料，分为两组：一组于25 ℃条件下暗培养；另一组每天光照10 h培养。经过15 d观察发现，黑暗培养下愈伤组织保持黄色或淡黄色、疏松的状态，生长旺盛，而光照培养下愈伤组织褐化加重、致密，生长相对缓慢。可见，相比光照培养，黑暗培养更适于曼地亚红豆杉愈伤组织的生长，如图2所示。

3结束语

为了系统研究适合曼地亚红豆杉愈伤组织诱导和生长的培养条件，本文首先分析了不同激素组合对曼地亚红豆杉愈伤组织诱导效果的影响。结果发现在本实验所设条件下，0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+2 mg/L 2，4-D是诱导愈伤组织生长的最佳激素组合，其中2，4-D起到了关键的诱导作用。这与已报道的是一致的，文献[13]研究表明，2，4-D浓度在1.0～3.0 mg/L时，红豆杉愈伤细胞长势良好，且细胞中紫杉醇含量与2，4-D浓度呈负相关。文献[14]的实验结果表明，2，4-D比NAA更有利于红豆杉愈伤组织的形成，在培养基中加入同等浓度的2，4-D和NAA，前者的诱导率明显高于后者，且在含有2，4-D的培养基上，愈伤组织颜色较新鲜、体积大、松软，而在含NAA的培养基中，愈伤组织褐化、体积小、较硬。

(a) 黑暗培养

(b) 光照培养图2　不同光照条件下曼地亚红豆杉愈伤组织诱导效果差异

接下来，我们研究了外植体取材部位对曼地亚红豆杉愈伤组织诱导的影响。在已有的报道中，多认为幼嫩茎段是诱导红豆杉愈伤组织形成的最佳外植体[15-16]，而本研究中增设了带芽茎段这一外植体，结果发现带芽茎段是相对更适合诱导愈伤组织的取材部位，具体表现在其初愈时间、愈伤组织诱导率及生长状态均明显优于叶片、幼茎及种子。

在研究光照条件对红豆杉愈伤组织诱导的影响时，我们发现，曼地亚红豆杉在黑暗培养下愈伤组织生长状态良好，而光照培养下愈伤组织出现褐化加重、生长缓慢的现象。说明黑暗培养更利于曼地亚红豆杉愈伤组织生长。许多前人研究得到过相似的结果，这可能是因为光照会提高多酚氧化酶(PPO)的活性，促进多酚类物质的氧化，从而会导致褐化现象加重，因此外植体在黑暗中培养可防止褐化的发生[14，17-18]。但也有研究证明，东北红豆杉、南方红豆杉在每天光照12h的培养条件下，愈伤组织诱导率高、生长状态好，而黑暗培养下愈伤组织则出现褐化加重的现象[19-20]，此种差异可能与红豆杉基因型及培养基成分有关。

另外，本研究在曼地亚红豆杉愈伤组织诱导的培养过程中，遇到的一个突出问题是褐化现象严重，导致愈伤组织生长缓慢甚至死亡。大多数研究者认为褐变主要是由于红豆杉属植物在组织和细胞培养中酚类物质代谢旺盛，多酚氧化酶被氧化为醌类物质，对细胞正常生理产生毒害而造成。另外，作为一种次生代谢物，紫杉醇的次生代谢途径与植物防御反应的一部分途径相重叠，从而进一步加重褐化的程度[21-23]。采用在培养基中添加活性炭、抗坏血酸、PVP等还原剂或酚类吸收剂，选择合适的继代周期，并且尽量避免外植体长时间与空气接触等措施可以对褐化起到一定的抑制作用[15，21-23]。如何有效控制曼地亚红豆杉愈伤组织褐化，保证愈伤组织正常生长，是我们今后研究必须解决的关键问题。

参 考 文 献

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收稿日期:2015-09-28

基金项目：四川大学大学生创新创业训练计划(20141007)。

作者简介：柳文静(1994 -)，女，本科生，生物科学专业。

中图分类号Q943.1

文献标志码A

doi:10.3969/j.issn.1672-4550.2016.03.054

Study on the Callus Induction Conditions of Taxus Media

LIU Wenjing，MIN Xia，GAO Ya，WEI Jingli，SHI Xiaoyun，ZHENG Dongchao

(School of Life Science，Sichuan University，Chengdu 610065，China)

AbstractPaclitaxel is a highly effective anticancer drug which is mainly extracted from Taxus species，it can be produced by cell culture technology.This study works on the effects of culture conditions such as the types of explants，the types and concentrations of hormones，illumination conditions on callus induction of Taxus media，in order to find out the most suitable culture conditions for Taxus media callus.The results showed that in the experimental conditions，the most suitable hormone combination for Taxus media callus induction was 0.5 mg / L NAA+0.2 mg / L 6-BA+2 mg / L 2，4-D.The most suitable explant was the stem with buds;Dark culture was more conducive to callus growth compared to light culture.This project can provide some references for the production of paclitaxel by cell culture.

Key wordsTaxus media;culture conditions;callus;induction