陕西省肿瘤医院内一科(西安 710061)

李　旭　安改丽△　王玉珍　李　楠▲



姜黄素联合吉西他滨对肝癌细胞HepG2增殖、凋亡的影响

陕西省肿瘤医院内一科(西安 710061)

李旭安改丽△王玉珍李楠▲

摘要目的：观察姜黄素、吉西他滨单药及联合用药对肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响。方法：使用不同浓度的姜黄素、吉西他滨以及两药联合分别作用肝癌细胞HepG2 24h、48h、72h。MTT法检测上述药物单用或联用对HepG2细胞的生长抑制作用；采用流式细胞仪检测其对HepG2细胞凋亡率的影响。结果：姜黄素、吉西他滨单药及联合用药对HepG2细胞有明显的生长抑制作用，存在时间剂量依赖关系，均可诱导HepG2细胞凋亡，联合用药有协同作用。结论：姜黄素、吉西他滨能够抑制HepG2细胞增殖，诱导细胞凋亡，两药联用有协同作用。

主题词肝肿瘤，实验性细胞增植细胞凋亡姜黄素/药理学@吉西他滨

恶性肿瘤是影响人类健康的最严重疾病之一，每年有近千万人死于恶性肿瘤[1]。肝癌是全球常见且恶性程度很高的肿瘤, 也是我国最常见的恶性肿瘤之一，具有发病率高、病死率高、生存期短等特点[2]。早期肝癌可考虑手术治疗，但因其起病隐匿，早期症状不典型，发现时多已是晚期，无手术机会，治疗以药物治疗为主，且疗效不佳[3]。祖国医学博大精深，中医中药在肿瘤治疗中有毒副作用相对较小、安全性高等特点。中医及中西医结合的方法在肝癌治疗中也越来越受到重视。姜黄素作为中药姜黄主要活性提取物, 有类非甾体类抗炎药(NSAIDs)的作用特点[4]。近年来其抗肿瘤作用被医学专家广泛关注。研究发现姜黄素对包括膀胱癌、乳腺癌、肝癌等在内的多种肿瘤细胞有增殖抑制作用[5-6]。姜黄素诱导细胞凋亡是其抗肿瘤作用的重要机制，涉及一系列复杂的生物学过程，并受细胞内外多种途径及信号分子调控，不同的途径所表现形式不同，它们之间有交叉，有重叠，构成了错综复杂的调控网络。本研究主要探讨姜黄素、吉西他滨单用及联合用药对人肝癌细胞HepG2体外增殖及凋亡的影响，为临床中西医结合治疗肝癌提供一定实验依据。

材料与方法

1材料与仪器肝癌细胞株HepG2(西安交通大学医学院医学中心实验室惠赠)；RPMI 1640培养基(美国GIBCO公司)；噻唑兰(MTT)(美国Sigma公司)；二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司)；Annexin-V/PI双染凋亡试剂盒(深圳晶美生物公司)；细胞培养箱( 美国Thermo 公司)；Genios 多功能酶标仪( 美国TECAN 公司)；倒置显微镜( DXM1200) 为日本Nikon 公司产品; 流式细胞仪为美国BD Calibur 产品。

2方法

2.1细胞培养：采用含10%小牛血清的RMPI-1640培养基培养肝癌细胞HepG2，培养于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中，其贴壁生长至70%～80%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的细胞用于实验。

2.2细胞增殖检测：取对数生长期的肝癌细胞HepG2以约1×104/ml密度接种于96孔板上，分别加入不同浓度的姜黄素(2.5 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40mmol/L)、吉西他滨(2.5 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L)和两药联合(姜黄素10 mmol/L+吉西他滨10 mmol/L)进行干预，每组5个复孔。以含相同浓度DMSO的培养液为对照，分别于培养24h、48h、72h后每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 ml，继续孵育4 h，终止培养，吸去孔内上清液，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，充分溶解结晶物。用多功能微板测试系统于490 nm处测定OD值。每组实验重复3次。抑制率(%)=(1-试验孔平均OD 值/对照孔平均OD值)×100%

2.3流式细胞仪检测细胞凋亡：取对数生长期的HepG2细胞消化后2 ml/孔接种至6孔板内，细胞浓度控制在1×106个/ml，分别加入浓度为10mmol/L 的CUR、GEM、CUR+GEM处理组药物分别处理HepG2细胞48h 后，收集各处理组HepG2细胞, 用PBS 洗涤二次收集细胞, 加入500μl Binding Buffer和FITC标记的Annexin V(20mg/ml)10ml，室温避光30min，再加入PI(50 mg/ml)5ml，避光反应5min后，立即用FACS进行流式细胞仪定量检测(一般不超过1h)，同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为对照。进行流式细胞仪的观察和检测。本实验重复3次。

3统计学方法运用SPSS18.0统计学软件，组间比较采用单因素方差分析，以α=0.05为检验标准。

结果

1姜黄素对HepG2细胞增殖的影响分别用不同浓度姜黄素处理肝癌细胞HepG2 24h、48h、72h后得到浓度-抑制率曲线图(图1)：可见姜黄素对肝癌细胞HepG2增殖具有明显的抑制作用，随着药物浓度的增大，抑制率明显增高；48h和72h的抑制率明显高于24h，呈时间与剂量依赖性。

2吉西他滨对HepG2细胞增殖的影响分别用不同浓度吉西他滨处理肝癌细胞HepG2 24h、48h、72h后得到浓度-抑制率曲线图(如图2)：可见吉西他滨对肝癌细胞HepG2增殖具有明显的抑制作用，随着药物浓度的增大，抑制率明显增高；48h和72h的抑制率明显高于24h，即呈时间与剂量依赖性。

3姜黄素联合吉西他滨对HepG2细胞增殖的的影响姜黄素、吉西他滨和姜黄素联合吉西他滨对HepG2细胞的增殖抑制作用(图3)：可见姜黄素、吉西他滨及二药联合组对HepG2肝癌细胞都具有明显的生长抑制作用，联合用药组的抑制率明显高于单药组。

图1　不同浓度姜黄素对肝癌细胞的浓度-抑制率曲线

图2　不同浓度吉西他滨对肝癌细胞的浓度-抑制率曲线

图3　不同实验组对细胞的时间-抑制率曲线

4不同实验组对肝癌HepG2细胞凋亡的影响用流式细胞仪检测HepG2细胞在不同作用条件下48h后的凋亡率。结果(图4)：可见对照组与用药组比较, HepG2 细胞的凋亡率较低, 差异有统计学意义(P<0.05)。姜黄素、吉西他滨单药组与联合用药组比较, HepG2细胞的凋亡率较低, 差异有统计学意义(P<0.05)。说明姜黄素可诱导肝癌HepG2细胞凋亡，诱导凋亡作用不及吉西他滨，但作为天然药物，通过联合用药可增加其诱导肝癌细胞凋亡的的作用。

图4　不同实验组作用于肝癌HepG2细胞48h后的凋亡图及凋亡率比较(与CON组相比,*P<0.05；与CUR组相比,# P<0.05；与GEM组相比,ΦP<0.05)

讨论

肿瘤细胞是体内具有无限增殖能力的细胞，肿瘤的发生不仅与细胞增殖有关，也与细胞凋亡失衡有关。抑制肿瘤细胞的增殖、促进凋亡是目前抗肿瘤治疗的热点。中药及其提取物的抗肿瘤作用已经得到医学专家的的广泛认可，开展其抗癌机制研究，具有重要的现实意义和理论价值。姜黄素作为从姜科植物黄姜根茎中提取的黄色酸性多酚类物质，不仅具有降脂、抗炎、抗氧化、抗病毒和预防突变等多种药理活性，也具有明显的抗肿瘤活性[8],且具安全性高、不良反应小等特点。目前,研究者普遍认为姜黄素抗肿瘤机制可能主要与抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡有关，通过调控线粒体凋亡通路及死亡受体通路在内的多条信号传导通路，引起肿瘤细胞凋亡；其抗肿瘤疗效确切，通过多个环节作为作用靶点起到抗肿瘤作用。他们各种途径之间存在着直接或间接的联系，单独或协同发挥抗肿瘤作用。王威等[9]研究现实，通过MTT法检测姜黄素对肝癌细胞有明显的生长抑制作用，随着剂量增加，其效应也相应增加，电镜结果显示经姜黄素作用后癌细胞超微结构发生改变，凋亡多见。胡庆华[10]等研究显示，姜黄素对宫颈癌HeLa有明显的抑制作用，作用机制可能通过内质网应激途径诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡有关。赵琳琳[11]等研究显示，姜黄素对肝癌细胞有明显的增殖抑制作用，并能诱导肝癌细胞凋亡，其作用机制可能与下调Wnt /β-catenin信号通路有关。邱伟等[12]研究发现，姜黄素不仅抑制肝癌HepG2细胞的增殖，并且可以通过下调COX-2及侵袭相关分子MMP-2及MMP-9的表达来抑制肿瘤细胞的侵袭能力。研究发现姜黄素对多种肿瘤有显著的抑制作用。姜黄素在发挥抗肿瘤治疗效果的同时，对正常细胞并无明显毒副作用，应用于人类十分安全，因而具有良好的临床应用潜力。

我们的实验通过MTT法检测姜黄素、吉西他滨单药及联合用药干预肝癌HepG2细胞的抑制率，结果显示单用及联合用药都对HepG2细胞有明显的生长抑制作用，且存在时间-剂量等效应关系。采用 AnnexinV/FITC双染色法检测细胞凋亡，结果显示姜黄素、吉西他滨可以诱导肝癌HepG2细胞凋亡，联合时作用更为明显，存在协同作用。姜黄素对肝癌HepG2细胞有明显的生长抑制作用，其作用机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关，然而姜黄素对肝癌HepG2细胞具体的抗癌机制有待进一步研究。

参考文献

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL,etal. Global cancer statistics, 2012[J]. CA: A Cancer Journal for Clinicians,2015,65(2):87-108.

[2] Chuang S C, La Vecchia C, Boffetta P. Liver cancer: Descriptive epidemiology and risk factors other than HBV and HCV infection[J]. Cancer Letters,2009,286(1):9-14.

[3] Robinson AIGA. Hepatocellular carcinoma: Epidemiology, risk factors and pathogenesis[J]. World Journal of Gastroenterology,2008,14(27):4300-4308.

[4]于冬青, 邓华聪.姜黄素的药理作用研究进展[J] .山东医药,2005, 45(2):72-73.

[5]Tharakan ST, Inamoto T, Sung B,etal. Curcumin potentiates the antitumor effects of gemcitabine in an orthotopic model of human bladder cancer through suppression

of proliferative and angiogenic biomarkers[J]. Biochem Pharmacol,2010, 79(2):218-228.

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[7] 苗久旺，张钦德.姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡的信号途径研究进展[J].陕西中医，2014，35(12)：1692-1694.

[8] Goel A, Kunnumakkara AB, Aggarwal BB. Curcumin as “Curecumin”From kitchen to clinic[J]. Biochemical Pharmacol, 2008,75(4):787-809.

[9]王威,贺红光,范丽,等.姜黄素对人肝癌细胞株HepG-2 生长及超微结构的影响[J].华中科技大学学报(医学版), 2005,34(3):323-325.

[10] 胡庆华,贺建文,赵小军. 姜黄素通过内质网应激途径诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡的实验研究[J]. 陕西医学杂志,2013,10:1279-1281,1325.

[11]赵琳琳,陈剑群,徐学军. 姜黄素对肝癌细胞Bel7402、QGY7703增殖凋亡及Wnt/β-catenin信号通路的影响[J]. 中华临床医师杂志(电子版),2013,11:4902-4906.

[12] 邱伟,刘阳,曹卫,等.姜黄素抑制肝癌细胞系HepG2的增殖、侵袭及其机制[J].现代肿瘤医学, 2015,23(22):3221-3225.

(收稿:2016-01-08)

通讯作者：▲西安市儿童医院

【中图分类号】R392.5

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.07.05

Effects of curcumin combined with gemcitabine on the proliferation and apoptosis of hepatocarcinoma cells HepG2 in vitro

Department of First Internal Medicine, Shaanxi Province Tumor Hospital(Xi’an 710061)

Li XuAn Gaili Wang Yuzhenet al

ABSTRACTObjective：To study the effect of curcumin (CUR), gemcitabine(GEM)and their synergergistic(CUR+GEM) effect on proliferation and apoptosis of Hepatocarcinoma cells HepG2. Methods:HepG2 was treated with CUR,GEM and CUR+GEM at different concentration and different time,HepG2 cells were tested for proliferation activity by MTT assay, and analyzed for apoptosis rate by flow cytometry. Results:CUR, GEM and CUR+GEM produced time-and dose-dependent inhibition of HepG2cells. CUR+GEM showed a higher apoptosis rate induction than CUR or GEM alone (P <0.05). Conclusion: CUR and GEM both have the effect of inhibition on the proliferation and induction of apoptosis in Hepatocarcinoma cells HepG2. Combining application can enhance apoptosis.

KEY WORDSLiver neoplasms,ExperimentalCell proliferationApoptosisCurcumin/pharmacology@Gemcitabine

△ 陕西省人民医院