黄　雯，徐　进，张　昊，许景升，丁　伟，冯　洁

（1西南大学植物保护学院，重庆 400716；2中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）



植物青枯菌LAMP检测方法的建立

黄雯1,2，徐进2，张昊2，许景升2，丁伟1，冯洁2

（1西南大学植物保护学院，重庆 400716；2中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

摘要：【目的】由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum，简称青枯菌）引起的青枯病（bacterial wilt of plants）是世界范围内危害最为严重的土传细菌病害之一，严重制约了多种经济作物的生产。建立高效、精准的早期诊断技术，是实现青枯病有效防控的基础。论文旨在建立一种能够特异检测青枯菌的环介导等温扩增方法（loop-mediated isothermal amplification, LAMP），实现青枯菌的田间快速检测。【方法】通过比对分析青枯菌的lpxC基因序列，并利用在线引物设计软件Primer Explorer Version 4.0得到4条LAMP特异性引物，F3（5′-CCTGTACGTGGTCGGCTAT-3′）、B3（5′-ACCGCAACACGGGATCA-3′）、FIP（5′-TACGCCGTTTCATCGGCCAGGTACACGGCGCACAAGT -3′）、BIP（5′-ATCGTCACGTTCGACAAGGTGGAATGCCGGCTGCAACTG-3′）。通过单因素变化试验对LAMP反应体系中的各参数进行优化，设置反应温度为60、61、62、63、64、65℃，设置镁离子浓度为2、4、6、8、10、12 mmol·L-1，设置内外引物浓度比为2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1，确定最优反应体系。以分离自不同寄主的24个青枯菌株为参试对象，5个非青枯菌株（Ralstonia mannitolilytica、Ralstonia pickettii、Enterobacter sp.、Acidovorax citrulli、Burkhoderia cepacia）为对照，验证LAMP检测方法的特异性。将青枯菌GMI1000菌株的基因组DNA进行10倍梯度系列稀释，以原液和101、102、103、104、105、106、107倍的稀释液为模板同步进行LAMP和普通PCR检测，比较两者的检测灵敏度。将马铃薯青枯病菌株Po41、姜青枯病菌株Z-Aq-1分别与马铃薯块茎和生姜根茎组织悬浮液混合，以LAMP检测方法对混合物进行检测，并以同样方法对表现典型萎蔫症状的人工接种番茄植株和健康植株以及田间马铃薯罹病块茎样品进行检测。……